本发明专利技术涉及一种生物防治菌Lnu-12的发酵条件。本发明专利技术以番茄叶霉病菌为指示菌，针对生防菌Lnu-12的发酵条件进行了研究，比较在不同的营养条件和培养条件下，生防菌株抗生素的产生情况。确定生物防治菌Lnu-12产生抗生素的最佳培养基配方为：玉米粉4.0％，KNO30.2％，FeSO40.02％，NaCl0.02％，CaCO30.2％。最佳发酵条件为：发酵培养基的初始pH是7.0，培养温度是28℃，摇床速度180r/min，培养时间为5天。本发明专利技术为该菌株的进一步生产、开发等工作提供科学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵
具体地涉及生物防治菌Lnu-12的发酵培养条件确定及优化。本专利技术所称的生物防治菌Lnu-12，命名为链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014554。
技术介绍
农作物病虫害是我国的主要农业灾害之一，农作物的生长由于受到病虫害的侵蚀而造成大量减产，利用化学药剂防治害虫的方法，是目前农作物防治害虫的最常用方法，如不用化学药剂防治，农产品产量的一半将被病、虫和草害夺去。但大量使用剧毒农药以及残留性化学农药，则容易造成污染，通过食物链危害人畜健康。农药量已相应增加，残留毒性加剧，害虫天敌被摧残，有一些害虫更加泛滥。由于化学农药的公害问题日益严重，近年来，生物防治作为植物病害防治的一项重要措施，已引起人们的高度重视。生物防治是利用有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治方法。因此开发高效，抗菌谱广的生物防治菌具有重要的意义。
技术实现思路
农用抗生素是微生物的次级代谢产物，其生产水平不仅取决于菌种本身的性能，而且还受营养条件、pH值大小、温度高低、甚至发酵时间等多种因素的影响和调控，这些因素相互作用又相互制约。本专利技术的目的是提供一种高效，抗菌谱广的生物防治菌Lnu-12，命名为链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014554。本专利技术的另一目的是提供优化的生物防治菌Lnu-12的发酵条件，为Lnu-12的工业化生产和应用提供理论基础。本专利技术的链霉菌Lnu-12，是从沈阳市东陵区蔬菜大棚土壤中分离筛选而得。将土壤样品稀释105，利用高氏一号培养基，采用常规的平板划线分离法进行分离培养，挑取放线菌单菌落，编号备用，筛选而得。1、链霉菌Lnu-12形态特征：Lnu-12在高氏一号培养基上生长良好，在菌落边缘无吸水斑，无可溶性色素产生。显微镜下观察，气生菌丝发达，多分枝；孢子丝多为直或波曲形，无紧密螺旋；孢子呈圆形、卵圆形。2、链霉菌Lnu-12生理生化特性：明胶液化、过氧化氢实验、纤维素水解、卵磷脂酶实验均呈阳性；牛奶凝固与胨化、淀粉水解、MR实验、硫化氢实验、色氨酸分解实验、硝酸盐还原实验均为阴性；可利用葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、淀粉、蔗糖、半乳糖、纤维二糖作为碳源生长，生理生化反应特性与淀粉链霉菌一致。3、链霉菌Lnu-12的16S rDNA序列分析方法：(1)链霉菌Lnu-12的DNA提取采用反复冻融法，以此为模板进行PCR扩增。(2)PCR引物：正向引物BSF8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′； 反向引物BSR1541/1522：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。(3)PCR引物由上海生物工程有限公司合成。(4)PCR反应体系(总体积29μL)：(5)PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃1.5min；30个循环； 72℃5min。本专利技术链霉菌Lnu-12菌株，PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成，测得的序列如SCQ ID No.1所示，将所测得的16S rDNA序列用BLAST搜索工具从GeneBank中调出与其相关的16S rDNA序列，然后用CLASTAL X软件进行多序列比对，并采用MEGA4.1软件中的邻位相接法(Neighbor-Joining)进行系统进化树的构建与同源性比较，所构建的系统进化树见图1，结合生理生化反应特性及培养特征鉴定链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)菌株为淀粉链霉菌瓦灰亚种(S.diastaticus subsp.Ardesiacus)。4、生物防治菌Lnu-12的发酵培养基，发酵培养基的碳源为玉米粉，氮源为KNO3。优化的发酵培养基的组成如下：按重量百分比，玉米粉4.0％、KNO3 0.2％、FeSO40.02％、NaCl0.02％，CaCO3 0.2％，余量为水。发酵的最佳培养时间是5天，发酵培养基的初始pH是7.0，装液量是50ml/250ml三角瓶，培养温度是28℃，摇床速度180r/min。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过确定了生物防治菌Lnu-12的最佳发酵条件，为Lnu-12的工业化生产和应用提供理论基础，采用本专利技术所述的发酵条件，Lnu-12发酵液50倍稀释液对番茄叶霉病具有显著的防治效果，防治效果可以达到70％，明显高于对照药剂。附图说明图1为Lnu-12菌株的系统发育进化树图2为不同碳源对抗生素生成的影响。图3为不同氮源对抗生素生成的影响。图4为不同初始pH对抗生素生成的影响。具体实施方式菌株：链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)，于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014554。供试病原菌：番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)，本实验室保藏。实施例1碳源对链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-12)发酵培养基的影响1)将链霉菌Lnu-12于斜面菌种培养基中活化培养；斜面菌种培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，蒸馏水1000ml，pH 7.2，121℃灭菌20min。2)发酵培养基：碳源3.0％，KNO3 0.15％，FeSO4 0.02％，CaCO3 0.2％，NaCl 0.01％，余量为水，pH 7.0(灭菌前)，121℃湿热灭菌20min。3)发酵：分别用玉米粉、甘油、果糖、蔗糖作为发酵培养基的碳源，以不加任何碳源作为空白对照，每一种配制三份培养液作为重复。121℃湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的链霉菌Lnu-12的菌悬液200ul，180r/min 28℃恒温摇床培养5d，8000r/min离心10min，取上清液，得不同的发酵液。4)杯碟法进行拮抗实验将4ml无菌水加入到番茄叶霉病原菌斜面中，用接种环刮下病原菌，制成菌悬液，备用。配制PDA琼脂培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水1000ml，pH自然，121℃灭菌20min，当PDA冷却到(未凝固)不烫手本文档来自技高网...
【技术保护点】
生物防治菌Lnu‑12的发酵培养基，其特征在于：发酵培养基的碳源为玉米粉，氮源为KNO3。
【技术特征摘要】
1.生物防治菌Lnu-12的发酵培养基，其特征在于：发酵培养基的碳源为玉米粉，氮源为
KNO3。
2.如权利要求1所述的生物防治菌Lnu-12的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养
基的组成如下：按重量百分比，玉米粉2.0-4.0％，KNO30.1-0.3％，FeSO40.01-0.02％，
NaCl 0.01-0.03％，CaCO30.1-0.3％，余量为水。
3.如权利要求2所述的生物防治菌Lnu-12的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养
基的组成如下：按重量百分比，玉米粉4.0％，KNO30.2％，FeSO40.02％，NaCl 0.02％，
CaCO30.2％，余量为水。
4.如权利要求1、2或3所述的生物防治菌Lnu-12的发酵培养基，其特征在于：所述的生
物防治菌Lnu-12，为链霉菌Lnu-12(Streptomyces sp.lnu-...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱春玉，佘晓双，张茂盛，郑甜甜，潘思明，刘宏生，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。