一种体外酶反应生成异戊二烯的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种体外酶反应生成异戊二烯的方法及应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术所提供的方法是将表达甲羟戊酸激酶基因，磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和异戊二烯合成酶基因分别导入宿主菌中，发酵培养所得的五种重组菌，再利用超声波分别破碎菌体获得粗酶液，混合五种粗酶液获得反应酶液，再向反应酶液中加入反应底物溶液后体外合成异戊二烯。本发明专利技术所提供的方法实现了利用酶反应在体外利用甲羟戊酸合成异戊二烯，实现了在体外通过精确控制代谢酶含量来合成异戊二烯。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种体外酶反应生成异戊二烯的方法及应用，属于生物工程

技术介绍
异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95％用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。随着分子生物学的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。Yang jianming等在大肠杆菌内过表外源MEP途径，通过发酵罐发酵48h后，异戊二烯产量达到300mg/L，产率仅为1.8％。Genencor公司以大肠杆菌为宿主菌，表达外源MVA途径相关酶及葛根异戊二烯合成酶，通过发酵优化使异戊二烯产量达到100g/L左右，但是其发酵时间长达88h，时间产率仅为1.33g/L/h，由于发酵过程中碳代谢流不能精确控制，其质量产率仅为8.3％。虽然通过MVA代谢途径制备异戊二烯及其相关的萜类化合物有了一定的进展，但是由于缺少相对稳定状态的动力学信息和合成途径中代谢通量的详尽了解，只是在细胞内通过相关酶的突变、改变酶的表达强度调节酶的含量以及调节各种酶的组合等复合<br>方法来调控目标产物的产量(Gibson,Methods Enzymol,498:349–361,2011；Shao and Zhao,Nucleic Acids Res 37(2):e16,2009；Parayil Kumaran Ajikumar et al.，Science,330(6000):70–74,2010)。这些方法具有很强的随机性，并不能够精确控制各种酶的组合及用量。通过非细胞的体外反应，可以在体外指导最佳的反应体系，通过精确的控制各酶的含量及添加相关的辅助因子用量，找出整个代谢途径中的关键因素，寻找关键步骤，确定关键酶。为细胞内代谢途径优化提供参考依据。刘天罡等在用九个纯化蛋白在体外构建了MVA代谢途径生产法呢烯，根据体外反应信息指导优化细胞内法呢烯的生产，使法呢烯产量提高了2000倍(Tiangang Liu et al.,Biotechnol.Bioeng,9999:1–10,2014)。目前，尚未有报道以甲羟戊酸为底物，利用五个粗蛋白体外构建异戊二烯合成代谢途径的相关报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种体外酶反应生成异戊二烯的方法，所采取的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种体外酶反应生成异戊二烯的方法，该方法是将表达甲羟戊酸激酶基因，磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和异戊二烯合成酶基因分别导入宿主菌，发酵培养所得的五种重组菌，再利用超声波分别破碎菌体获得粗酶液，混合五种粗酶液获得反应酶液，再向反应酶液中加入反应底物溶液后体外合成异戊二烯所述方法的步骤如下：1)将获得的甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、戊烯焦磷酸异构酶基因IDII和异戊二烯合成酶基因Isps4分别构建入宿主菌表达质粒载体中，获得五种重组质粒；2)将步骤1)所得的五种重组质粒分别导入宿主菌，获得五种重组菌；3)发酵培养步骤2)所得五种重组菌，分别表达甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、戊烯焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶；4)收集步骤3)所培养的菌体，分别超声破碎后，获得五种粗酶液；5)按比例混合步骤4)所得的五种粗酶液，获得反应酶液；6)向步骤5)所得的反应酶液中加入反应底物溶液，混合反应液；7)将步骤6)所得的混合反应液，转移至厌氧反应瓶中，补水后密封，在室温下静置反应120min，获得异戊二烯溶液。所述基因来源为化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒。优选地，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII，来源于粪肠球菌、酿酒酵母、金黄色葡萄球菌或肺炎双球菌；所述异戊二烯合成酶基因Isps4，来源于葛根或柏杨。优选地，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，GeneBank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII，GeneBank登录号为855986；所述异戊二烯合成酶Isps4，GeneBank登录号为AB198180。所述宿主菌为大肠杆菌、酿酒酵母或枯草芽孢杆菌。所述培养重组大肠杆菌是，将已构建的重组大肠杆菌接种于100ml LB培养基中，摇床37℃180rpm培养至OD600为0.6-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-1.0mmol·L-1，20℃培养12-18小时。培养结束后在4℃8000rpm条件下离心5min收集菌体，用5ml pH7.4磷酸盐缓冲液洗涤三次，超声波破碎：22kHz,150W,10分钟，破碎后4℃，15000rpm离心5min，收集上清，即为粗酶液。所述超声破碎，超声频率为22kHz,超声功率为150W，超声时间为10min。所述混合五种粗酶液，是调整甲羟戊酸激酶的浓度至60-160μg/L；磷酸甲羟戊酸激酶60-160μg/L；甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶60-160μg/L；异戊烯焦磷酸异构酶60-160μg/L；异戊二烯合成酶60-160μg/L。优选地，所述混合五种粗酶液，是调整甲羟戊酸激酶的浓度至160μg/L，磷酸甲羟戊酸激酶80μg/L；甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶80μg/L；异戊烯焦磷酸异构酶60μg/L；异戊二烯合成酶160μg/L。所述反应底物溶液，含有50mM磷酸盐缓冲溶液，4mM ATP，30mM KCl，8mM MgCl2，0.2mM MnCl2，0.01mM ZnSO4，4mMβ-巯基乙醇和2.5mM甲羟戊酸。所述方法用于利用甲羟戊酸为底物或中间产物，体外酶反应生产异戊二烯以及异戊二烯基单元合成的萜类化合物。更进一步，本方法还提供了一种以甲羟戊酸为中间产物，体外酶反应生产目的产物的方法。是在精确调控各种酶及辅助因子用量的基础上，进一步利用甲羟戊酸为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外酶反应生成异戊二烯的方法，其特征在于，将表达甲羟戊酸激酶基因，磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和异戊二烯合成酶基因分别导入宿主菌，发酵培养所得的五种重组菌，再利用超声波分别破碎菌体获得粗酶液，混合五种粗酶液获得反应酶液，再向反应酶液中加入反应底物溶液后体外合成异戊二烯。

【技术特征摘要】
1.一种体外酶反应生成异戊二烯的方法，其特征在于，将表达甲羟戊酸激酶基因，磷酸甲羟
戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和异戊二烯合成酶
基因分别导入宿主菌，发酵培养所得的五种重组菌，再利用超声波分别破碎菌体获得粗酶
液，混合五种粗酶液获得反应酶液，再向反应酶液中加入反应底物溶液后体外合成异戊二
烯。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)将获得的甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸
脱羧酶基因ERG19、戊烯焦磷酸异构酶基因IDII和异戊二烯合成酶基因Isps4分别构建
入宿主菌表达质粒载体中，获得五种重组质粒；
2)将步骤1)所得的五种重组质粒分别导入宿主菌，获得五种重组菌；
3)发酵培养步骤2)所得五种重组菌，分别表达甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲
羟戊酸焦磷酸脱羧酶、戊烯焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶；
4)收集步骤3)所培养的菌体，分别超声破碎后，获得五种粗酶液；
5)按比例混合步骤4)所得的五种粗酶液，获得反应酶液；
6)向步骤5)所得的反应酶液中加入反应底物溶液，混合均匀后获得混合反应液；
7)将步骤6)所得的混合反应液，转移至厌氧反应瓶中，补水后密封，在室温下静置反
应120min，获得异戊二烯溶液。
3.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶
基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII，来源于
粪肠球菌、酿酒酵母、金黄色葡萄球菌或肺炎双球菌；所述异戊二烯合成酶基因Isps4，来
源于葛根或柏杨。
4.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，G...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，程涛，赵广，邹慧斌，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37