羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术制造技术

羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术。本发明专利技术提供了一种检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，包括如下步骤：对基因组 DNA中的5-hmC进行糖基化修饰以及对照组反应；限制性内切酶MspI酶切消化；接头A的连接；Bst DNA polymerase fragment 处理；EcoP15I或MmeI酶切；片段选择；P7接头连接；PCR扩增；PCR产物的回收；文库质控。本发明专利技术检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法具有如下优势：可以同时检测全基因组内几乎全部CCGG位点的不同修饰即甲基化和羟甲基化的丰度；具有高通量、高准确性并可降低实验和测序误差；不依赖于重亚硫酸盐的转换，弥补了传统甲基化检测技术中无法分辨甲基化和羟甲基化修饰的缺点。

【技术实现步骤摘要】
羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术。
技术介绍
5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是早在1952年发现的存在于噬菌体中胞嘧啶的一种修饰形式，也是最近同时在小鼠的神经元和胚胎干细胞中检测到的存在于哺乳动物基因组中的又一种修饰方式。随后，大量的研究集中于揭示5hmC和TET蛋白家族氧化酶在基因组组织以及鼠干细胞分化中可能承担的角色，并且证明TET蛋白酶家族可以通过氧化作用将5mC转换为5hmC。而Tet家族酶与疾病的发展与调控有关。已报道TET蛋白和5hmC存在于许多不同的组织中，并且它们的表达/活性在胚胎干细胞分化过程中受到严格调控。TET1和TET2均与癌症有关：TET1在急性骨髓样白血病(AML)和急性淋巴样白血病(ALL)中是MLL的的一个配体，而TET2功能的缺失也与急性骨髓样白血病(AML)以及各种骨髓细胞生成障碍综合征和骨髓增生性疾病密切相关。TET蛋白和hmC引起DNA甲基化失调，在胚胎干细胞多潜能性，致癌性转化以及神经元的功能中可能具有重要作用。然而，尽管5hmC修饰碱基早在50年前就在噬菌体中发现，然而目前几乎没有一种有效的酶或化学的方法可以特异性识别5hmC残基并分辨其在基因组中的具体分布。例如甲基化依赖性内切酶MspJI家族或McrBC均不能分辨5mC和5hmC，而甲基化敏感类内切酶如MspI或HpaII等，在大多情况下，5mC和5hmC对其有相同的影响。之前认为是检测甲基化金标准的重亚硫酸盐处理分析同样不能有效地分辨是5mC修饰还是5hmC修饰。最近随着5hmC特异性抗体的出现，依赖于免疫学检测5hmC的技术如斑点印迹分析技术、细胞免疫荧光或免疫组化分析技术等已被广泛应用于羟甲基化相关的科学研究之中,但这些技术基本上都只限于检测5hmC在组织或细胞内的存在与否或表达量的高低，而不能定位其在基因组上的分布。目前，在全基因组范围内检测5hmC分布的技术主要集中在富集捕获结合测序分析的策略，如：hMeDIP、anti-CMS、JBP-pulldown等，但所有这些富集捕获的实验方法均不足以达到单碱基精确分辨5hmC在DNA序列内精确分布的程度,而且依赖于抗体或蛋白捕获的该类技术大多受到非特异性捕获以及捕获偏好性的限制。最近基于生物氧化反应建立起来的TAB-Seq和基于化学氧化建立起来的oxBS-seq可以检测全基因组的羟甲基化修饰，而且可以进行单碱基分辨，但是这两种检测方法所需要的数据量巨大且实验技术不宜在普通实验室建立，其广泛应用受到限制。另一方面，用于检测5hmC在全基因组或不同细胞或组织中含量的检测方法却不断发展，5hmC在不同细胞或组织中含量的检测也不仅限于胚胎干细胞和脑组织中了。令人兴奋的是最新两个研究分别运用免疫组化和免疫测定的方法检测到5hmC在胚胎和成体组织均广泛存在。免疫测定发现5hmC在脑、肝、肾和结肠直肠组织中的百分含量比较高为0.40-0.65％，而在肺组织中含量相对较低为0.18％，在心脏，乳房和胎盘中的含量极低，仅为0.05-0.06％。相对正常结肠直肠组织0.46-0.57％的百分含量，该研究同样检测发现在癌变的结肠直肠组织中其含量仅为0.02-0.06％。这表明更亟待需要建立一种能够精确检测5hmC在基因组范围内精确分布的大规模检测技术，为进一步研究5-羟甲基胞嘧啶在基因组内的分布及其相关的表观调控机制提供一种有力的工具，也为进一步探索其对相关疾病的发生发展或在个体发育过程中所承担角色的实现提供前提条件。最近，NEB公司根据T4噬菌体β-葡糖基转移酶(T4-BGT)可以高效的将尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-Glucose)的葡萄糖单元转移至双链DNA的5-羟甲基胞嘧啶残基上，形成的β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5gmC)不能被MspI切开的原理建立了一种检测基因组CCGG位点甲基化和羟甲基化修饰的技术，具体如下：首先，全基因组经过MspI酶切，在酶切效率为100％的基础上，基因组所有的CCGG位点均可被切开(包括甲基化修饰和羟甲基化修饰位点)；第二步，酶切后的片段以dCTP为底物，经过Klenowfragment的作用形成5’突出一个碱基C的粘性末端；第三步，4％的丙烯酰胺凝胶回收40-300bp范围的经Klenowfragment修复的DNA片段；第四步，回收片段连接5’突出碱基G的双链接头(接头可以介导后续的PCR扩增和测序)；第五步，连接接头的回收片段经BGT糖基化修饰，则基因组原序列的CCGG位点如果含有羟甲基化修饰，则形成5gmC；第六步，连接接头后的糖基化修饰产物再进行MspI酶切，如果原CCGG位点是羟甲基化修饰，则连接的接头不会被切下来；第七步，取1/3的上述产物进行PCR扩增，测序，只有两端都有接头的序列即两端都是羟甲基化修饰的序列可以检测到。剩余2/3的产物分两份，每份各取1/3不直接进行PCR扩增，而分别在dCTP底物的作用下，经过Klenowfragment再次进行末端修复，形成一端或两端突出一个碱基C的粘性末端产物，然后在连接酶的作用下连接另外一种接头，连接产物中的一份直接进行PCR扩增，测序。另一份经HpaII酶切后再次经过末端修复和接头连接，PCR扩增测序。这样第一组检测到的序列两端的CCGG位点均羟甲基化修饰，第二组检测到的序列的一端为羟甲基化修饰，而另一端为甲基化修饰或不修饰，第三组检测到的序列的一端为羟甲基化修饰，而另一端为非修饰的CCGG位点。该技术需要经过多次的连接和酶切反应,DNA的CCGG粘性末端连接和酶切效率相对较低，特别是经过糖基化修饰后的连接和酶切效率可直接影响检测的准确性。此外，该技术主要是应用于基于PCR扩增的单基因或位点的检测，目前应用于高通量检测的具体方法和数据还没有报道。此外，研究者运用T4噬菌体β-葡糖基转移酶(T4-BGT)修饰建立了一种HMST-seq的技术，该技术可以检测基因组大部分CCGG位点甲基化和羟甲基化修饰状态。借助5hmC经过糖基化修饰后不能被MspI限制性内切酶切割，而5mC和5C均可被MspI切开的原理，设计了一套含有生物素修饰的接头和含MmeI酶切位点的接头，全基因组依次经过糖基化修饰、MspI酶切、生物素修饰的接头连接、NlaIII酶切、链霉素磁珠捕获、以及含MmeI酶切位点的接头连接和MmeI酶切等操作构建文库，借助高通量测序仪精确检测5hmC在全基因组范围内的精确定位，建立一种单碱基分辨，精确检测5hmC的技术。该技术需要构建3个不同的文库，由于人为的浓度计算会引入相应的误差，影响检测准确性。此外，该技术检测的并不是直接的CCGG位点，而是在基因组上与其相邻的CATG位点，因此不论是基因组结构的变异还是信息关联的算法都会导致检测位点关联的错误。此外，由于非直接检测CCGG位点，需要保证所有的DNA片段内都具有CATG位点，这大大降低了基因组检测的范围。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是降低实验成本、高通量、提高基因组检测范围以及增加数据分析的准确性的检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法。本专利技术提供了一种检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：设置三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：设置三组反应，其中一组对核酸进行糖基化处理，其余两组的核酸未经糖基化处理；步骤二：将步骤一中经糖基化处理后的核酸的一组和未经糖基化处理的核酸的一组分别平行进行MspI酶切反应；将步骤一中剩余的未经糖基化处理的核酸的一组同时进行HpaII酶切反应；步骤三：将步骤二中三组中的每组的酶切片段分别连接含有不同Index且同时包含Ecop15I或MmeI酶切位点的接头A，将连接有不同的接头A的各组的核酸混合到一起，得到一个包含无修饰、甲基化修饰和羟甲基化修饰的核酸文库；步骤四： 运用Bst DNA 聚合酶将核酸文库中的双链DNA接头中有缺口的一条链进行修复；步骤五：对上一步得到的核酸进行Ecop15I或MmeI酶切，产生短片段DNA序列；步骤六：回收连接接头A的短DNA片段；步骤七：将一段有两个碱基粘性末端的P7接头与步骤六的连接接头A的短DNA片段进行连接； 步骤八：以接头A和P7接头的DNA序列设计通用引物对步骤七得到的连有P7接头及接头A的短DNA片段进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，建立测序文库；步骤九：对步骤八得到的测序文库进行测序，分析比较序列信息，获得核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的信息。...

【技术特征摘要】
1.一种检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：设置三组反应，其中一组对核酸进行糖基化处理，其余两组的核酸未经糖基化处理；步骤二：将步骤一中经糖基化处理后的核酸的一组和未经糖基化处理的核酸的一组分别平行进行MspI酶切反应；将步骤一中剩余的未经糖基化处理的核酸的一组同时进行HpaII酶切反应；步骤三：将步骤二中三组中的每组的酶切片段分别连接含有不同Index且同时包含Ecop15I或MmeI酶切位点的接头A，将连接有不同的接头A的各组的核酸混合到一起，得到一个包含无修饰、甲基化修饰和羟甲基化修饰的核酸文库；步骤四：运用BstDNA聚合酶将核酸文库中的双链DNA接头中有缺口的一条链进行修复；步骤五：对上一步得到的核酸进行Ecop15I或MmeI酶切，产生短片段DNA序列；步骤六：回收连接接头A的短DNA片段；步骤七：将一段有两个碱基粘性末端的P7接头与步骤六的连接接头A的短DNA片段进行连接；步骤八：以接头A和P7接头的DNA序列设计通用引物对步骤七得到的连有P7接头及接头A的短DNA片段进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，建立测序文库；步骤九：对步骤八得到的测序文库进行测序，分析比较序列信息，获得核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的信息；所述接头A序列为三对：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；SEQIDNO：3和SEQIDNO：4；SEQIDNO：5和SEQIDNO：6；所述P7接头序列为SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；所述步骤八中的进行PCR扩增所...

【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，王君文，夏渝东，吉冠玉，
申请(专利权)人：深圳市易基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44