Sso7d-Sau重组DNA聚合酶制造技术

本发明专利技术涉及一种Sso7d-Sau重组DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I(Sau)蛋白序列N端以柔性连接序列共价连接Sso7d蛋白而得到的杂合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明专利技术还提供了编码该蛋白的基因以及该蛋白的制备方法和用途。本发明专利技术改造后的DNA聚合酶催化活力维持不变，但是持续合成能力显著提高，并且对盐的耐受性提高，在田间和现场检测过程中能够显著提高重组酶介导的核酸恒温扩增技术的DNA扩增效果，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种Sso7d-Sau重组DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I(Sau)蛋白序列N端以柔性连接序列共价连接Sso7d蛋白而得到的杂合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供了编码该蛋白的基因以及该蛋白的制备方法和用途。本专利技术改造后的DNA聚合酶催化活力维持不变，但是持续合成能力显著提高，并且对盐的耐受性提高，在田间和现场检测过程中能够显著提高重组酶介导的核酸恒温扩增技术的DNA扩增效果，具有广泛的应用前景。【专利说明】Sso7d-Sau重组DNA聚合酶
本专利技术属于分子生物学和蛋白质工程领域，涉及一种Sso7d-Sau重组DNA聚合酶。
技术介绍
在生物学研宄、医学检验、法医鉴证及农业等相关领域，核酸的扩增都是一种非常 重要的技术。目前，应用最为广泛的核酸扩增技术是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)。PCR技术利用反应温度的循环变化来实现目的序列的变性、复性和延伸， 能够在2-3小时之内实现目的序列的指数级扩增。然而，由于PCR技术依赖体积大、耗电量 高、价格昂贵的PCR仪来实现，限制了其在现场及田间检测中的广泛应用。 近些年，在DNA、RNA合成的分子生物学领域有许多的研宄进展，许多在体内核酸 扩增过程中发挥重要辅助作用的蛋白被相继发现。在这些研宄进展的基础上，人们开发了 多种恒温核酸扩增技术，如转录介导的核酸扩增技术、链置换核酸扩增技术、环介导核酸恒 温扩增技术，及重组酶介导的核酸扩增技术等。与传统的PCR技术相比，恒温核酸扩增技术 除了脱离PCR仪，能够在恒温条件下进行核酸扩增的优势以外，有一些恒温核酸扩增技术 还对一些扩增反应的抑制因素具有更高的耐受能力。 重组酶介导的核酸扩增技术是新近开发的恒温核酸扩增技术之一。该技术模拟生 物体内DNA的复制过程，利用酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白来介导模板链的解链以 及实现模板和扩增引物之间的链替换；在SSB蛋白的辅助下，DNA聚合酶可以对链替换后的 DNA实现特异性的延伸。该技术由ATP供能，并由磷酸肌酸催化实现ATP的再生。37°C恒温 条件下，重组酶介导的核酸扩增技术能够在20-60min之内实现对目的片段的指数级别扩 增。该技术还能够与SYBR green I，SYT0-13或SYT0-82等共同作用，利用肉眼可见荧光染 料来对扩增结果进行判断。这样既可以避免反复开关反应管而造成交叉污染的问题，又无 需依赖具有致癌性的核酸电泳试剂以及昂贵的凝胶成像系统，使得重组酶介导的核酸扩增 技术的应用与传统的PCR技术相比更加便捷，也更加适用于现场和田间检测使用。 重组酶介导的核酸恒温扩增技术中使用的DNA聚合酶是枯草芽孢杆菌DNA聚合酶 I (Bacillus subtilis Pol I，Bsu)或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Pol I， Sau)，这两种DNA聚合酶均属于DNA聚合酶I家族。DNA聚合酶I家族是负责DNA复制过程 中损伤修复的聚合酶，该家族中大部分DNA聚合酶的持续合成能力都不高，也就是说该家 族的聚合酶与模板结合一次能催化的聚合反应数目较少。 Sso7d是一种来源于嗜热菌种Sulfolobus solfataricus的非特异性DNA结合蛋 白。有研宄表明，将Ss〇7d与来源于DNA聚合酶I家族和II家族的高温DNA聚合酶共价连 接，能够显著提高高温DNA聚合酶的持续合成能力。另外，还有研宄证明，低温DNA结合辅 助蛋白（37°C )能够在高温（60°C )发挥DNA结合的作用，也就是说，DNA结合蛋白有可能 在非最适条件下也能正常发挥作用。因此，将Ss〇7d与低温DNA聚合酶Sau共价连接或许 能够为DNA聚合酶的改造提供一种新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种Sso7d_Sau重组DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA 聚合酶I (Sau)N端共价连接来源于嗜热菌种Sulfolobus solfataricus的DNA结合蛋白 Ss〇7d，力求克服DNA聚合酶I家族中大部分DNA聚合酶的持续合成能力不高的问题。 本专利技术的第二个目的是提供编码上述Sso7d_Sau重组DNA聚合酶的基因。 本专利技术的第三个目的是提供上述Sso7d_Sau重组DNA聚合酶的制备方法。 本专利技术的第四个目的是提供上述Sso7d_Sau重组DNA聚合酶的用途。 本专利技术通过以下技术方案来实现： 一、一种Sso7d-Sau重组DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)蛋 白序列N端以柔性连接序列共价连接Sso7d蛋白而得到的杂合DNA聚合酶，其氨基酸序列 如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列。 二、编码上述的Sso7d-Sau重组DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。 三、上述的Sso7d_Sau重组DNA聚合酶的制备方法，该方法包括以下步骤： (1)根据GenBank已经公布的Sau基因序列以及Sso7d基因序列信息设计并合成 引物，并通过Overlap PCR技术扩增得到带有纯化标签、酶切位点的Sso7d_Sau序列； (2)将步骤（1)中得到的Sso7d-Sau克隆至表达载体pTrc99A中构建重组载体 pTrc99A-Sso7d-Sau ； (3)表达载体pTrc99A-Sso7d_Sau转化大肠杆菌、诱导表达得目的蛋白 Sso7d_Sau〇 四、上述的Sso7d-Sau重组DNA聚合酶在常温核酸扩增技术中的应用。 采用上述技术方案的积极效果：本专利技术对恒温核酸扩增技术中DNA聚合酶进行了 分子生物学改造，改造后聚合酶的持续合成能力得到有效提高，并且在重组酶介导的核酸 恒温扩增反应中对盐的耐受性大幅提高；在田间和现场进行核酸检测时，由于采用比较简 便的DNA提取技术，因此DNA样品模板常不够纯，可能含有盐离子等扩增抑制类物质；改造 后的DNA聚合酶，由于对盐具有更高的耐受能力，因此在田间和现场检测过程中能够显著 提高重组酶介导的核酸恒温扩增技术的DNA扩增效果，具有广泛的应用前景。 【专利附图】【附图说明】 图1是Ss〇7d、Sau蛋白三维结构预测结果及共价连接位置指示； 图2是pTrc99A-Sso7d-Sau重组质粒构建示意图； 图3是pTrc99A-Sso7d-Sau重组质粒酶切鉴定结果； 图中，M Marker，lpTrc99A-Sso7d_Sau 质粒，2pTrc99A-Sso7d_Sau 质粒双酶切产 物； 图 4 是 Sso7d_Sau 蛋白 SDS-PAGE 分析结果； 图中，M Marker，l诱导前，2诱导后，3上清，4沉淀，5流穿，6目的蛋白（约75KD); 图5是Sau和Sso7d_Sau持续合成能力检测的电泳峰图； 图中，横坐标表示加入的核苷酸量，纵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Sso7d‑Sau重组DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I(Sau)蛋白序列N端以柔性连接序列共价连接Sso7d蛋白而得到的杂合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，翟冰，周国辉，李贤祯，刘国宪，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11