一种适于蛋白质组学的牛支原体外膜蛋白提取方法技术

本发明专利技术涉及一种适于蛋白质组学的牛支原体外膜蛋白提取方法。该方法包括菌体培养与收集、液氮研磨、恒温超声震荡、离心收集蛋白质沉淀、用乙醇和丙酮漂洗，然后用真空冷冻离心干燥，获得蛋白粉末后裂解处理；将裂解后的溶液混匀，离心后保留上清液，即得到牛支原体外膜蛋白。本发明专利技术对蛋白的提取步骤和使用试剂进行优化，大大提高了蛋白提取的效率和纯净度，有效除去了双向电泳中干扰第一向和第二向的杂质，和传统方法相比，方法简便、省工省时、蛋白提取效率高、干扰物少，可获得分辨率高、重复性好、蛋白点分布均匀、蛋白点清晰的图谱，对牛传染性胸膜肺炎支原体组学的研究及免疫蛋白的筛选研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及。该方法包括菌体培养与收集、液氮研磨、恒温超声震荡、离心收集蛋白质沉淀、用乙醇和丙酮漂洗，然后用真空冷冻离心干燥，获得蛋白粉末后裂解处理；将裂解后的溶液混匀，离心后保留上清液，即得到牛支原体外膜蛋白。本专利技术对蛋白的提取步骤和使用试剂进行优化，大大提高了蛋白提取的效率和纯净度，有效除去了双向电泳中干扰第一向和第二向的杂质，和传统方法相比，方法简便、省工省时、蛋白提取效率高、干扰物少，可获得分辨率高、重复性好、蛋白点分布均匀、蛋白点清晰的图谱，对牛传染性胸膜肺炎支原体组学的研究及免疫蛋白的筛选研究具有重要意义。<b/>【专利说明】
本专利技术涉及一种外膜蛋白的提取方法，具体涉及一种适于蛋白质组学的牛支原体 外膜蛋白提取方法，属于生物
。
技术介绍
牛传染性胸膜肺炎又称牛肺疫，是由丝状支原体所致牛的一种高度接触性传染性 肺炎。该病以肺间质淋巴管、结蹄组织和肺泡组织的渗出性炎症以及浆液性纤维素性胸膜 肺炎为主要特征。本病的易感动物主要是奶牛、肉牛、黄牛、水牛、牦牛等。各种牛对本病的 易感性不同，依其品种、生活方式及个体抵抗力不同而有差别，发病率为60~70%，病死率为 30~50%，其他动物及人无易感性。传染源主要是病牛及带菌牛，大多呈隐性感染。该病近年 来在我国发生呈逐年上升的趋势，已成为危害养牛业最严重的疾病之一，给我国养牛业造 成严重的经济损失。 随着现代科学技术的飞速发展，许多种类的生物基因组测序已经完成，现代生命 科学技术研究的重点已经从结构基因组研究转移到后基因组时代，即功能基因组的研究。 蛋白质是基因功能的体现者，执行生理功能。在众多生物学机制研究中，许多问题在基因水 平上不能完全被揭示，所以要研究其功能，从其体现者蛋白质角度来研究。蛋白质组学是以 蛋白质组为研究中心，在整体水平上系统研究细胞或组织的全部蛋白质信息，具有大规模、 高通量的特点。21世纪是生命科学领域的大发展时期，基因组学研究已进入后基因组学时 代，即功能蛋白质组学。蛋白质组学的研究内容非常广泛，主要包括以下几个方面：结构蛋 白质组学、表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、差异蛋白质组学等几个方面的内容。二维凝 胶电泳（2-dementional gel electrophoresis, 2-DE)是目前蛋白质组学研究中最成熟、 最经典的蛋白分离技术。这项技术是建立在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，从蛋白质的等 电点和分子量这两个特征将复杂的蛋白质成分进行高通量的分离，首先根据等电点不同在 固定PH梯度的干胶条中等电聚焦（IEF)，将蛋白进行第一向分离，然后再垂直方向按照分 子量的大小进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分离，实现横向和纵向两个方向 的分离，提高了蛋白分离的灵敏度。二维凝胶电泳是蛋白质组学研究中常用的一种蛋白质 分离技术，其步骤较多，研究内容复杂，主要包括：原料的采集与回收、蛋白质的提取、蛋白 质的纯化、蛋白质的透析脱盐、第一向等电聚焦、第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱鉴定、生 物信息学分析研究等内容。 双向电泳技术是蛋白质组学研究中常用的一种蛋白质分离技术，包括样品制备、 胶条水化、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶固定及染色等一系列步骤。目前，2-DE技术 凭着高通量、高分辨率、高灵敏度和重复性好等特点，仍不失为蛋白质组学研究中最常用的 蛋白质分离方法。虽然2-DE技术可以将组织或细胞或体液样品中绝大部分蛋白质分离，在 生命科学研究领域中应用的也越来越广，但是仍存在许多问题需要解决。等电聚焦对样品 的要求极其严格，若样品中含有过多杂质将使等电聚焦过程终止。目前有很多种蛋白质的 提取方法，但没有一种方法是通用的，因此要对不同生物组织采取不同的措施。细菌中含有 大量干扰物质，这些物质严重干扰等电聚焦及影响电泳图谱的分析。如对于极酸、极碱、过 大过小、难溶蛋白质的分离以及电泳图谱的重复性和分辨率不佳，疏水性蛋白和大分子蛋 白很难转入第二向电泳，痕量调控蛋白往往会被高含量的结构蛋白掩盖，这些缺陷往往与 蛋白的提取方法相关，在一定程度上使2-DE技术在蛋白质组学方面的应用受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供，该 方法操作简便、蛋白提取效率高、杂质少，不干扰第一向等电聚焦和第二向的聚丙烯酰胺凝 胶电泳，为牛传染性胸膜肺炎丝状支原体的蛋白组学研究、疫苗候选和蛋白筛选提供技术 支持和理论基础。 本专利技术的技术方案： 一种适于蛋白质组学的牛支原体外膜蛋白的提取方法，包括以下步骤： (1) 菌体的培养与收集，收集在支原体培养基上生长的细菌，经菌体培养，得到冷冻保 存的菌体，备用； (2) 取冷冻菌体，用液氮研磨，准确称取一定量的菌体粉末至离心管中；往离心管中加 入等量的蛋白提取液；将所得溶液充分混匀，恒温超声震荡； (3) 在转速为12000 rpm的离心机中4°C离心15 min，收集上清液，向上清液中加入5 倍体积10%的TCA-丙酮，置于-20°C沉淀过夜，然后4°C条件下在转速为12000 rpm离心 机中离心30 min，收集蛋白质沉淀；所述TCA-丙酮中含有0. 5%的β -二巯基乙醇； (4) 将所述蛋白质沉淀用95%的乙醇漂洗两次，然后用-20°C的丙酮漂洗三次，用真空 冷冻离心干燥机处理，获得蛋白粉末； (5) 将蛋白粉末加入样品裂解液进行裂解处理； (6) 将裂解后的溶液充分混匀，于4°C在12000 rpm的离心机中离心15 min，保留上清 液，即得到牛支原体外膜蛋白，将该外膜蛋白保存于_80°C的冰箱中，备用。 所述菌体培养过程为：取收集的支原体培养基上生长的细菌，以2000 rpm的转速 于离心机中离心10 min，除去多余的培养基，用预冷的pH 7. 0的PBS缓冲液清洗3次，清洗 干净后将菌体沉淀移至离心管中，每个离心管装入的细菌量为离心管总体积的1/3,用移液 枪移除多余的PBS缓冲液，用封口膜封住管口，-80°C冷冻保存菌体，备用。 所述一定量的菌体粉末为0. 1-0. 15g ;其中恒温超声震荡时要求：恒温4°C，震荡 时间为10-20 min，功率为120 W。 所用蛋白提取液的组成为：5 M的尿素、4 M的硫脲、45 mM的DTT、6%的CHAPS、 1. 2%的载体两性电解质溶液，载体两性电解质的pH值为3-10,其余为纯净水。 所述样品裂解液的组成为：2%的CHAPS、8 M的尿素、50 mM的DTT、0.02%的溴酚 蓝、2%的载体两性电解质溶液。 本专利技术的积极有益效果： 本专利技术对牛传染性胸膜肺炎支原体外膜蛋白的提取方法进行优化，建立一套稳定、高 效、适于双向电泳的牛支原体的外膜蛋白提取方法。与传统方法相比，该方法具有省工省 时、操作简便，蛋白提取效率高、杂质少、能有效除去等电聚焦干扰物等优点；另外，该方法 优化了蛋白提取裂解液，并且将液氮研磨与超声震荡处理相结合，使细胞内的蛋白有效释 放出来，提高了蛋白的提取效率和质量。该方法适合于蛋白难提取的材料及杂质含量较多 的材料。 本专利技术在蛋白上清液中加入含有一定量β-二巯基乙醇的TCA-丙酮，可有效除去本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适于蛋白质组学的牛支原体外膜蛋白的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）菌体的培养与收集，收集在支原体培养基上生长的细菌，经菌体培养，得到冷冻保存的菌体，备用；（2）取冷冻菌体，用液氮研磨，准确称取一定量的菌体粉末至离心管中；往离心管中加入等量的蛋白提取液；将所得溶液充分混匀，恒温超声震荡；（3）在转速为12000 rpm的离心机中 4℃离心15 min，收集上清液，向上清液中加入5倍体积10% 的TCA‑丙酮，置于‑20℃沉淀过夜，然后4℃条件下在转速为12000 rpm 离心机中离心30 min，收集蛋白质沉淀；所述TCA‑丙酮中含有0.5%的β‑二巯基乙醇；（4）将所述蛋白质沉淀用95%的乙醇漂洗两次，然后用‑20℃的丙酮漂洗三次，用真空冷冻离心干燥机处理，获得蛋白粉末；（5）将蛋白粉末加入样品裂解液进行裂解处理；（6）将裂解后的溶液充分混匀，于4℃在12000 rpm的离心机中离心15 min，保留上清液，即得到牛支原体外膜蛋白，将该外膜蛋白保存于‑80℃的冰箱中，备用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李海利，魏成斌，张震，徐引弟，朗利敏，张青娴，候自花，蔺萍，游一，施巧婷，杨素新，崔忠华，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41