利用混合的多官能性表面降低蛋白制剂中聚集物含量的方法技术

降低抗体和其他蛋白制剂的聚集物水平的方法，包括如下步骤：用有机多价阳离子(例如，依沙吖啶、氯己定或聚乙烯亚胺)处理，以及用包含具有负电性化学部分的表面和具有正电性化学部分的表面的组合的组合物处理。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】降低抗体和其他蛋白制剂的聚集物水平的方法，包括如下步骤：用有机多价阳离子(例如，依沙吖啶、氯己定或聚乙烯亚胺)处理，以及用包含具有负电性化学部分的表面和具有正电性化学部分的表面的组合的组合物处理。【专利说明】利用混合的多官能性表面降低蛋白制剂中聚集物含量的方 法
本专利技术涉及用于纯化蛋白尤其是抗体的材料。其具体涉及用于降低蛋白聚集物含 量的材料。其还涉及将这些能力与其他纯化方法整合以实现蛋白的期望水平的最终纯化。 专利技术背景 已证明宿主细胞来源的污染物与通过体外细胞培养方法产生的重组蛋白间自 发形成非天然的异源聚集物（Shukla et al. ,Biotechnol. Progr. (2008)24:1115-1121; Luhrs et al. , J. Chromatogr. B(2009)877:1543-1552 ；Mechetner et al. , J. Chromatogr. B(2011)879:2583-2594 ；Gagnon et al. , J.Chromatogr.A, (2011) 1218:2405-2412 ； Gagnon, Bioprocessing J. (2010) 9 (4): 14-24)。这些异源聚集物在两个方面可被认为是非 天然的：1)组成性污染物常常为非人来源的，由活的非人宿主细胞分泌，或在非人的宿主 细胞死亡裂解后释放至培养基中。在活的人体中，不存在此类非人的污染物；以及2)相比 人体内系统（其中死细胞组分被快速清除），组成性污染物积累至较高浓度。因此，组成性 产物以在生命系统中通常不会出现的浓度暴露于高水平的强相互作用的污染物。同时，高 表达水平的重组蛋白使得其成为适于与这些非人的污染物非特异性结合的底物，从而促进 不同组分的非期望异源聚集物的形成。 异源聚集物的污染蛋白含量在某种程度上通过直接靶向污染蛋白（Shukla et al.和Gagnon et al.，同上）和间接通过革El向针对污染蛋白的对应的DNA组分（Luhrs et al.和Gagnon,同上）进行处理。已证明在一些复合物解离时出现了抗体聚集物水平的降 低（Shukla et al·，Mechetner et al.和Gagnon,同上）。已公开了阴离子交换剂降低抗 体-污染物复合物水平的能力（Luhrs et al.和Gagnon et al·，同上），但还未证明存在能 够完全清除异源聚集物的阴离子交换处理。尺寸排阻、阳离子交换和疏水相互作用层析法 也被用于尝试降低异源聚集物，但这些技术通常不如阴离子交换（Gagnon et al.，同上）。 与抗体形成稳定结合物的污染物的具体来源并非总是已知的（参见，例如Shukla et al.同上）。一些努力聚焦于DNA污染物，而很少注意到其他可能的污染物的具体来源 (Gagnon et al.和Gagnon,同上）。一些证明宿主污染物与抗体制备中的聚集物关联性的 努力特别地聚焦于包含核染色质降解产物的污染物（Luhrs et al.和Mechetner et al.同 上）。在这些实例中，聚合可直接通过抗体对核染色质代谢产物如组蛋白和DNA的免疫特异 性介导。还证明核染色质代谢产物能够通过非特异性相互作用与抗体形成稳定复合物。因 此，对不包含核染色质代谢产物的抗原具有已知免疫特异性的单克隆抗体，可与来源于死 的宿主细胞的细胞核的核小体、组蛋白和DNA形成具有不同类型的高度稳定的聚集物。特 别地，已证明核染色质代谢产物在高分子量（HMW)聚集物中有高度代表性。HMW聚集物特 别值得关注，因为其疑似参与促进治疗中和性抗体的形成。HMW聚集物通常被定义为大小 比目标抗体的较小倍数更大的聚合物。例如，2-抗体结合物不被认为是HMW聚集物，大多 数4-抗体聚集物也不是。然而，大小大得多的聚集物如对应于约8至约10或更多的抗体 的聚集物通常可被归类为HMW聚集物。 用预期可能解离异源聚集物的试剂处理抗体制剂证明通常是无效的。例如，采用 高浓度的尿素、盐或二者的组合不会大幅解离IgM-污染物异源聚集物（Gagnon et al.同 上）。以尿素、乙醇和表面活性剂在洗脱前洗涤的蛋白A亲和层析被证明相比无洗涤能够更 有效地降低异源聚集物水平（Shukla et al.同上），其与将尿素、盐和EDTA与蛋白G亲和 层析结合的洗脱前洗涤一样（Mechetner et al.同上）。以尿素在洗脱前洗涤的阴离子交 换层析被证明相比无尿素洗涤能够更有效地降低异源聚集物（Gagnon et al.同上）。具有 洗脱前的EDTA洗涤的阳离子交换层析也被证明相比无洗涤能够更有效地降低异源聚集物 (Gagnon et al.同上）。最后，具有尿素和/或盐的洗脱前洗涤的羟磷灰石相比无此类洗 涤也能够更有效地降低异源聚集物（Gagnon同上）。尽管存在这些观察结果，一般而言，将 解离剂用于与层析柱结合的抗体的洗脱前洗涤仅存在适度的成功。 有机多价阳离子已被证明能够用于沉淀酸性蛋白（Farhner et al.，美国专 利申请第 20080193981 号；Ma et al.，J. Chromatogr. B (2010) 878:798-806 ;Peram et aI. , BiotechnoI. Progr. , (2010) 26:1322-1326 ；Glynn, U. Gottschalk(ed. ), Process Scale Purification of Antibodies, J. T. Wiley and Sons, (2009)Hoboken, 309-324), 和用于沉淀 DNA 和内毒素 （Glynn 同上；(^(1686七31.，13;111〇1· Progr., (1990) 6:283-285 ；Dissing et al. , Bioseparation, (1999)7221:9-11),以及 使病毒失活（Bernhardt,美国专利5, 559, 250)。还证明多价金属阳离子能够从一些 蛋白制剂去除 DNA 和内毒素 （Akcasu et al.，Nature, (1960) 187:323-324 ;Matsuzawa et al. , Nucl. Acids Res. , (2003) 3 (3) : 163-164 ；Christensen et al. , Prot. Expr. Purif. , (2004)37:468-471 ；Kejnovsky et al. , Nucl. Acids Res. , (1997)25:1870-1871 ； Ongkudon et al·，Anal. Chem·，（2011)83391:13-17)。 专利技术概述 在某些实施方案中，本专利技术提供了降低样品如含有期望蛋白的蛋白制剂的聚集物 含量的方法；某些方法包括如下步骤：（i)提供第一组件，其为具有负电性表面的第一固相 基底；（ii)提供第二组件，其为具有正电性表面的第二固相基底；（iii)将所述样品与所述 第一组件和第二组件接触，其中所述第一组件和第二组件经配本文档来自技高网...

【技术保护点】
降低含有所需蛋白的样品的聚集物含量的方法，其中所述方法包括如下步骤：(i)提供第一组件，其为具有负电性表面的第一固相基底；(ii)提供第二组件，其为具有正电性表面的第二固相基底；(iii)将所述样品与所述第一组件和第二组件接触，其中所述第一组件和第二组件经配置使得所述样品可同时接触两个组件，其中操作条件基本上阻止所述所需蛋白与所述第一组件或第二组件的结合；以及(iv)从所述第一组件和第二组件分离所得样品，所述所得样品含有所需蛋白并具有降低的聚集物含量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·加尼翁，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG