一种忍冬藤提取物及其作为免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种忍冬藤提取物及其作为免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用。本发明专利技术制得的忍冬藤提取物在个体水平上，提高中华绒螯蟹成活率；在体液免疫方面，显著提高其血淋巴血清中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力、一氧化氮浓度和抗菌肽基因的表达；在细胞免疫方面，提高血淋巴细胞总数，抑制凋亡基因的表达。本发明专利技术为防治中华绒螯蟹病菌侵害及提高免疫应答水平提供一种纯天然免疫增强剂，具有明显的抗菌、抗病毒、无毒副作用、无污染、成本低、制备方法简单的特点，拓宽了忍冬藤的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种忍冬藤提取物及其作为免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用。本专利技术制得的忍冬藤提取物在个体水平上，提高中华绒螯蟹成活率；在体液免疫方面，显著提高其血淋巴血清中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力、一氧化氮浓度和抗菌肽基因的表达；在细胞免疫方面，提高血淋巴细胞总数，抑制凋亡基因的表达。本专利技术为防治中华绒螯蟹病菌侵害及提高免疫应答水平提供一种纯天然免疫增强剂，具有明显的抗菌、抗病毒、无毒副作用、无污染、成本低、制备方法简单的特点，拓宽了忍冬藤的应用范围。【专利说明】一种忍冬藤提取物及其作为免疫増强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用
本专利技术涉及一种忍冬藤提取物及其作为免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用。
技术介绍
中华绒鳌蟹(Er1cheir sinensis)，又名河蟹，是我国极为重要的特种水产经济动物。自20世纪80年代以来，其养殖业迅速发展，2007年全国成蟹养殖产量已达48.95万吨(2007中国渔业统计年鉴)，产值达到300多亿元，已成为水产养殖支柱产业之一。随着中华绒螯蟹人工养殖的迅猛发展，其病害日趋严重，尤其是细菌性与病毒性疾病的频繁爆发，给养殖产业造成了巨大损失，严重制约了中华绒螯蟹养殖产业的可持续发展。 到目前为止，由病原生物引起的流行病已导致养殖业遭受重大经济损失。病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫一直在威胁着水产养殖业的安全。因此，寻找预防与治疗的措施迫在眉睫。在传统的疾病预防和治疗过程中，化学药物和抗生素被大规模施用，这些药物的滥用带来的环境危害，如破坏自然微生态系统，影响有机废物的降解、抗药病原生物的产生等，以及在生物体内残留对人类健康的潜在不良影响越来越受到人们的关注。因此，开发成本低、毒副作用低、不易产生抗药性、作用效果显著的免疫增强剂，提高水产动物的免疫功能和机体免疫应答能力，已经成为免疫增强剂研宄领域的发展趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种忍冬藤提取物，该提取物制备方法简单，制备的产品杀菌、抗病毒作用强、无毒副作用、无污染、成本低。 本专利技术的另一目的在于提供一种忍冬藤提取物作为免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用。以忍冬藤提取物作为免疫增强剂用于中华绒螯蟹的养殖，可显著提高中华绒螯蟹免疫应答能力。 本专利技术采用以下技术方案:一种忍冬藤提取物，其特征在于，它是由以下步骤制备得到:(1)烘干:将忍冬藤清洗干净后置于烘箱中进行干燥，得到干燥的忍冬藤；(2)提取:将干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以5_12倍量50%_95%乙醇浸泡24小时后，水浴加热回流提取1-3次，每次0.5-2 h，合并滤液；(3)浓缩:将合并滤液利用旋转蒸发仪减压浓缩至2-5ml，压力为0.08MPa，温度40-50 0C ；(4)将上述获得的浓缩液进行放入冷冻室冷冻，然后在冷阱温度为_45°C，真空状态下干燥至粉末得粉末状忍冬藤提取物。 上述步骤(I)中烘干温度为90_95°C，时间为8-10小时。 上述步骤(2)中回流温度为75°C。 上述步骤(4)中冷冻室温度为-15°C ~_25°C，冷冻时间为4_6小时；冷冻干燥时间6-8小时，真空度为0.8Pa。 本专利技术还提供了一种忍冬藤提取物作为免疫增强剂在中华绒螯蟹养殖中的应用。利用本专利技术的忍冬藤提取物作为免疫增强剂添加到养殖中华绒螯蟹所需的各种基础饲料中，如白鱼粉、田螺肉粉、花生饼粉、豆饼粉、甜玉米粉、骨粉、农虾肉粉等，制备成具有杀菌和抗病毒作用强、无毒副作用、无污染、成本低的养殖中华绒螯蟹的优异饲料，其中复配饲料中忍冬藤提取物所占重量百分比为1%-3.0%。 本专利技术进行了一系列免疫攻毒实验研宄。研宄结果表明:嗜水气单胞菌感染后，在个体水平上，忍冬藤提取物能够提高中华绒螯蟹成活率；在体液免疫方面，忍冬藤提取物能显著提高其血淋巴血清中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力、一氧化氮浓度和抗菌肽基因的表达；在细胞免疫方面，忍冬藤提取物提高血淋巴细胞总数，抑制凋亡基因的表达。因此，忍冬藤提取物可通过调节中华绒螯蟹体液免疫和细胞免疫应答水平来增强中华绒螯蟹的固有免疫应答能力。 本专利技术的有益效果:在个体水平上，提高中华绒螯蟹成活率；在体液免疫方面，显著提高其血淋巴血清中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力、一氧化氮浓度和抗菌肽基因的表达；在细胞免疫方面，提高血淋巴细胞总数，抑制凋亡基因的表达。本专利技术为防治中华绒螯蟹病菌侵害及提高免疫应答水平提供一种纯天然免疫增强剂，具有明显的抗菌、抗病毒、无毒副作用、无污染、成本低、制备方法简单的特点，拓宽了忍冬藤的应用范围。 【专利附图】【附图说明】 图1是LTE对中华绒螯蟹死亡率的影响结果；图2是LTE对中华绒螯蟹血淋巴溶菌酶活力的影响结果；图3是LTE对中华绒螯蟹血淋巴酚氧化物酶活力的影响结果；图4是LTE对中华绒螯蟹血淋巴一氧化氮浓度的影响结果；图5是LTE对中华绒螯蟹血淋巴细胞抗菌肽基因CrusEd表达水平的影响结果；图6是LTE对中华绒螯蟹血淋巴细胞总数的影响结果；图7是LTE对中华绒螯蟹血淋巴细胞中凋亡基因Caspase表达水平的影响结果；图8是LTE对中华绒螯蟹血淋巴细胞中凋亡基因nm23表达水平的影响结果。 【具体实施方式】 下面通过【具体实施方式】对本专利技术做进一步的详细说明。 实施例1攻毒实验对正常和嗜水气单胞菌免疫刺激中华绒螯蟹体液免疫和细胞免疫影响的实验。 实验材料:忍冬藤提取物；嗜水气单胞菌(中国科学院海洋研宄所宋林生课题组);中华绒螯蟹250只，体重150±30 g，购买自山东省青岛市南山水产批发市场，过滤海水适应性暂养2周，温度(18 土 2) V。 试剂:溶菌酶和一氧化氮试剂盒为南京建成生物工程研宄所产品；L-DOPA (3，4-二羟基苯丙氨酸)、磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、葡萄糖、二水合柠檬酸、柠檬酸三钠为国药产品；RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒为TAKARA公司产品。 实验方法:2.1忍冬藤提取物(LTE)的制备(1)烘干:将忍冬藤清洗干净后置于烘箱中于90-95°C干燥8-10小时，得到干燥的忍冬藤；(2)提取:将干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以5_12倍量50%_95%乙醇浸泡24小时后，水浴加热回流提取2-3次，回流温度75°C，每次1-2 h，合并滤液；(3)浓缩:将合并滤液利用旋转蒸发仪减压浓缩至2-5ml，压力为0.08MPa，温度40-50 0C ；(4)将上述获得的浓缩液进行放入_15°C~_25°C冷冻室冷冻4-6小时，然后在冷阱温度为_45°C，冷冻干燥6-8小时，真空度为0.8Pa，得粉末状忍冬藤提取物。 2.2 LTE对中华绒螯蟹免疫应答水平的影响将中华绒螯蟹分为空白组、PBS组、嗜水气单胞菌注射组(Ah组)、10MIC浓度处理组(LTE10)、100MIC浓度处理组(LTE100)，每组50只。其中，LTElO组和LTE100组提前24h注射不同浓度忍冬藤提取物。24h后，Ah组、LTElO组和LTE100组分别从中华绒螯蟹足间基膜处注射10(^1^嗜水气单胞菌(5.0\10\扣/1^)。注射后，分别于他、311、611、1211、2411和48h随机从各实验组取6只中华绒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种忍冬藤提取物，其特征在于，它是由以下步骤制备得到：烘干：将忍冬藤清洗干净后置于烘箱中进行干燥，得到干燥的忍冬藤；提取：将干燥的忍冬藤粉碎至3‑5mm的小段，以5‑12 倍量50%‑95%乙醇浸泡24小时后，水浴加热回流提取2‑3 次，每次1‑2 h，合并滤液；浓缩：将合并滤液利用旋转蒸发仪减压浓缩至2‑5ml，压力为0.08MPa，温度40‑50℃；将上述获得的浓缩液进行放入冷冻室冷冻，然后在冷阱温度为‑45℃，真空状态下干燥至粉末得粉末状忍冬藤提取物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：史晓委，张海娟，许彦来，王振，石少英，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37