本发明专利技术目的是提供一种植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子，其特征在于：所述特异性标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KdpA蛋白质的基因，并位于植物乳杆菌ST-III来源的pST-III质粒上。本发明专利技术的另一个目的是提供一种检测植物乳杆菌ST-III的引物对，其特征在于：该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子的序列形同，引物长度为15-40bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性分子标记的序列互补，引物长度为15-40bp，该引物对扩增片段长度为200-1773bp。具有如下优点：检测速度快、特异性高、灵敏度高、成本低。
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测植物乳杆菌ST-III的引物及其检测方法和试剂盒
本专利技术涉及一种快速检测植物乳杆菌ST-III的引物及其检测方法和试剂盒，属于生物
技术介绍
植物乳杆菌ST-III是一株典型的益生菌，自身具有降低胆固醇、降血脂、提高人体免疫力等多种益生功能。该菌株的基因组已于2010年测定并公布，同时该菌株已经作为发酵剂应用于工业生产，但目前市场相对混乱，存在大量以假乱真、以次充好的现象。目前已经确定植物乳杆菌ST-III的很多益生功能与其自身的pST-III质粒密切相关，而且pST-III质粒决定了植物乳杆菌ST-III一些特殊性质。pST-III质粒大小为53.6kbp，多拷贝，而且核苷酸序列也已经被公布测定。这些核苷酸序列的公布可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为同种细菌不同菌株间的区分和鉴定奠定基础。经分析发现pST-III质粒存在一个编码钾离子转运基因簇Kdp，此基因簇赋予植物乳杆菌ST-III极强的耐盐性，而且是目前为止在乳杆菌中仅在植物乳杆菌ST-III发现这一钾离子转运簇。这为植物乳杆菌ST-III进行分子标记，并提供特异性的检测方法提供额可能。分子检测主要是PCR方法检测具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、成本低的优势，因此建立植物乳杆菌ST-III的PCR方法能快速的将植物乳杆菌ST-III与其它植物乳杆菌菌株区分开来，从而检测市场上以假乱真、以次充好的乳制品，对乳制品的监管，具有很强的应用价值。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子，其特征在于：特异性标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KdpA蛋白质的基因，位于植物乳杆菌ST-III来源的pST-III质粒上。本专利技术所提供的特异性标记分子，还可以具有这样的特征：的特异性标记分子的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第720位至第1200位所示。本专利技术的另一个目的是提供一种检测植物乳杆菌ST-III的引物对，其特征在于：该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子的序列中的一段相同，长度为15-40bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性分子标记的序列中的一段互补，长度为15-40bp，该引物对扩增出的片段长度为200-1773bp。本专利技术所提供的引物，还可以具有这样的特征，的引物对中，一条引物的序列如SEQIDNO.2所示，另一条引物的序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的又一个目的在于提供一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括上述目的中所提供的引物对。根据本专利技术所提供的试剂盒，其特征在于：的试剂盒还包括dNTP，10×PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。本专利技术再一个目的在于提供一种植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，提取待测样品菌株中的质粒DNA；步骤二，以步骤一所得质粒DNA为模板，以上述目的中所提供的引物对进行PCR反应；步骤三，将步骤二所得PCR反应产物进行电泳检测，检测是否存在权利要求3或4的引物扩增出的片段。另外，本专利技术所提供的植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中的PCR反应的反应体系包括引物对，该引物对中的两种引物的浓度均为0.5mmol/L；0.2mmol/L的dNTP；1×PCRbuffer；1.5mmol/L的Mg2+；0.02U/μL的TaqDNA聚合酶；以及1.0-2.0ng/μL的DNA模板。另外，本专利技术所提供的植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，还可以具有这样的特征：步骤二中的PCR反应程序为：95℃,3min；95℃下45s,55℃下45s,72℃下1min，进行30个循环；72℃，5min；4℃保存。本专利技术的再一个目的在于提供一种上述特异性标记分子作为植物乳杆菌ST-III菌株的特征序列在检测植物乳杆菌ST-III菌株中的应用。专利技术作用与效果本专利技术所提供的特异性检测植物乳杆菌ST-III菌株的引物及其检测方法和试剂盒，具有如下优点：1.检测速度快、特异性高与传统的微生物的生化培养鉴定技术的整个鉴定周期需要5-7天相比，本专利技术所提供的检测方法只需要3-4个小时，检测速度明显变快。本专利技术所设计的引物对根据编码植物乳杆菌ST-IIIKdpA蛋白质基因的特异性标记片段设计，该引物可以在编码植物乳杆菌ST-III菌株中扩增出相应的DNA片段，并且只特异性的扩增植物乳杆菌ST-III的基因，而不能在其他乳杆菌中扩增出相应片段，包括NCBI已报道的经过全基因组(含质粒)测序的乳杆菌菌株，说明以该基因片段为基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。2.灵敏度高、成本低PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克级的起始待测模板扩增到微克水平，因此灵敏度高。而且本专利技术中的模板为多拷贝的质粒(约10个拷贝)，因此与一般的以基因组为模板的PCR方法相比，本专利技术中的方法能再提高一个数量级的灵敏度，因此本专利技术中的方法灵敏度更高。此外，与通过全基因组序列测序区分同类细菌间不同菌株的方法相比，费用大为降低、实验周期也大为缩短，可以很方便地投入实际应用。具体实施方式以下说明本专利技术的具体实施方式实施例1酸奶中植物乳杆菌ST-III的检测取10ml酸奶，8000g离心10min，弃上清，取沉淀。以去离子水洗沉淀2次，用质粒提取试剂盒(SanPrep柱式质粒DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程有限公司)提取菌体的质粒DNA。然后以所提取DNA为模板进行PCR反应。PCR反应体系为：0.5mmol/L的上游引物，0.5mmol/L的下游引物，0.2mmol/L的dNTP，1XPCRbuffer，1.5mmol/L的Mg2+，0.02U/uL的TaqDNA聚合酶，1uL的DNA模板，加去例子水至20ul。PCR反应程序为：95℃,3min；将95℃下45s，55℃下45s，72℃下1min，对以上三步进行30个循环；72℃5min；4℃保存。最后进行电泳检测，取5ulPCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为100V，电泳时间为40min。以DNA分子量标记为对照进行检测。结果显示在紫外灯下存在480bp的核酸片段，说明待测样品中存在植物乳杆菌ST-III。实施例2特异性验证选择选择不同的植物乳杆菌菌株20株，包括5株植物乳杆菌植物亚种，5株不同来源的植物乳杆菌ST-III，3株植物乳杆菌P8菌株，2株植物乳杆菌299v菌株，1株植物乳杆菌ATCC8014，1株植物乳杆菌CCFM8610，1株植物乳杆菌CCFM8724，1株植物乳杆菌CCFM8661，1株植物乳杆菌CW006。其它种乳杆菌50株，包括10株嗜酸乳杆菌，5株动物乳杆菌，5株短乳杆菌，5株布氏乳杆菌，5株解淀粉乳杆菌，5株卷曲乳杆菌，5株德氏乳杆菌，5株发酵乳杆菌，5株干酪乳杆菌，利用本专利技术所提供的引物对进行PCR反应，PCR扩增体系和程序以及电泳的具体操作参照实施例1。结果显示在紫外灯下，只有植物乳杆菌ST-III有较亮的480bp电泳条带，其它菌株和菌种均没有480bp电泳条带。说明设计的PCR引物检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物乳杆菌ST‑III菌株的特异性标记分子，其特征在于：所述特异性标记分子是编码植物乳杆菌ST‑III的KdpA蛋白质的基因，位于植物乳杆菌ST‑III来源的pST‑III质粒上。
【技术特征摘要】
1.一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的引物对，其特征在于：该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性标记分子的序列中的一段相同，长度为15-40bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的特异性分子标记的序列中的一段互补，长度为15-40bp，该引物对扩增出的片段长度为200-1773bp，所述引物对中，一条引物的序列如SEQIDNO.2所示，另一条引物的序列如SEQIDNO.3所示。2.一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括如权利要求1所述的引物对。3.如权利要求2所述的检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，其特征在于，还包括：dNTP；10×PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。4.一种植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，提取待测样品菌株中的质粒DNA；步...
【专利技术属性】
技术研发人员：艾连中，王光强，夏永军，陈卫，王彦波，郭本恒，宋馨，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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