一种中温α-淀粉酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种中温α-淀粉酶的制备方法，属于酶制剂制备技术领域。以通过氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变获得的枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304，经菌种活化、液体种子培养、发酵罐培养等步骤制备而成，制备的中温α-淀粉酶酶活力高达7000-9600U/ml；最适作用温度为65℃，该酶在65℃条件下保存24h仍具有80-83％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50-60％以上酶活；该酶最适反应pH值为5.0，在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活，比现有的中温α-淀粉酶酶活力更高，酶作用最适pH值范围更宽泛，耐温度更高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

【技术实现步骤摘要】
一种中温α-淀粉酶的制备方法
本专利技术属于酶制剂制备
，特别涉及一种中温α-淀粉酶的制备方法。
技术介绍
α-淀粉酶全称为α-1,4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故得名为α-淀粉酶。α-淀粉酶是最重要的一类酶，也是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种，占酶制剂市场月25％的份额。其中，中温α-淀粉酶是一类最适反应温度处于50-70摄氏度之间的α-淀粉酶。这类酶的最适反应温度较高，所以其适用范围非常广。目前，中温α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵等行业，也用于饲料、轻化工业、食品、造纸、医药、石油开采等各个领域。中温淀粉酶在医药行业的应用：助消化：用于消化药物，一是在胃中促进淀粉消化、减轻胃部胀感；二是将淀粉水解成糖分，使之易于被机体吸收，使用中温α-淀粉酶，降解淀粉，降低粘度，帮助消化。抗炎净创类药品的应用：中温α-淀粉酶是目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。中温α-淀粉酶和其他酶联合运用能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽，腐肉和碎屑。还能够分解脓液中的核蛋白，使之成为简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性，达到洁净创口、消炎抗肿的目的。中温淀粉酶对淀粉原料的处理：在发酵行业中一般使用的原料中都含有淀粉，例如生产酒精、酿酒、食醋等，这些淀粉一般都是粗原料，使用α-淀粉酶和糖化酶对原料预处理，方便微生物发酵。尤其是中文α-淀粉酶的应用更简化了生产的能耗，下面列举一些应用中温α-淀粉酶处理淀粉原料的例子：葡萄糖生产：葡萄糖是淀粉糖工业中产量最大的一个部门，生产出来的葡萄糖进一步精制可应用到制药行业，生产葡萄糖传统工艺是使用酸水解淀粉，但是必须使用精制淀粉作原料。40年代发展的酶法生产，专一性高，不需要精制淀粉，污染小。目前广泛使用的是双酶法制糖工艺，先用耐高温α-淀粉酶进行连续喷射液化，加入糖化酶进行间歇式糖化，这样不但增加能耗，而且成本高，采用中温淀粉酶就解决了这个问题，具有很好的发展前景。有机酸生产：柠檬酸、乳酸、衣康酸和苹果酸等有机酸的生产主要通过微生物发酵方法获得，在微生物发酵时都需要使用淀粉作为原料，包括红薯或玉米等，都不适宜在高温下进行，所以使用前都需要使用中温α-淀粉酶进行水解处理。中温淀粉酶在添加剂中的应用：在许多时候还需要报中温α-淀粉酶作为食品添加剂、饲料添加剂或者辅助添加剂添加到食品、饲料、药品和日化产品中去。在饲料中添加中温α-淀粉酶其主要作用是补充动物内源酶的不足，提高饲料中淀粉的利用率，尤其是幼龄动物对淀粉的利用率。目前在饲料生产中α-淀粉酶主要和纤维素酶、蛋白酶、植酸酶等酶类混合使用添加到饲料当中，在畜禽的肠道内发挥作用，分解饲料中的淀粉类物质，促进消化，提高利用率。洗涤剂用酶主要添加蛋白酶，其次是α-淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。其与蛋白酶配合使用，用于洗衣粉，液体洗涤剂。特别在以淀粉为主要食物的地区，在洗涤剂中添加淀粉酶很普遍。对α-淀粉酶的要求是低温活性高，与洗涤剂的其他组分，特别是表面活性剂有很好的相容性，有出色的稳定性。目前应用的中温α-淀粉酶一般在60度上下表现出良好的活性，适合在洗涤剂中使用。由此可见，近年来中温淀粉酶已经引起研究人员的广泛关注，具有广阔的应用前景，但是现有的中温α-淀粉酶在发酵时的最大酶活都难以令人满意，特别是在需要进行液化糖化的工艺当中存在需要反复调节pH值的缺陷，因此急需研发出发酵时最大酶活较高且使用pH较宽泛的中温α-淀粉酶的生产方法，以满足日益增长的工业化生产需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种中温α-淀粉酶的制备方法。本专利技术提供的产中温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌304Bacillussubtilis304。该菌株已于2013年11月24日保藏于中中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCCNO:M2013600。所述枯草芽孢杆菌304由一株分离自酸性土壤的产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌出发菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，菌株特点如下：所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥褶皱，色暗不透明，边缘整齐，镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性，周生鞭毛，芽孢呈椭圆形。一种中温α-淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：(1)菌种活化将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，30-37℃培养24-36h进行菌种活化，如此活化2-3次；所述斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g,琼脂15-20g，蒸馏水l000mL，pH值5.5-6.5，121℃灭菌20min；(2)液体种子扩大培养①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种1-2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床250转/分，培养温度30-37℃，培养时间10-15h；②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床250转/分，培养温度30-37℃，培养时间10-15h；④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30-37℃，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V)1:1-2,罐压0.05Mpa,培养时间10-20h；所一级、二级、三级种子培养基重量组成为：酵母粉0.3-0.5％，葡萄糖1-1.5％，蛋白胨0.3-0.5％，牛肉膏0.5-0.8％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，中草药剂粉1.5-2％，海藻糖1-3％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1-3g，不足部分纯净水补足，pH值5.5-6.5，121-123℃灭菌30-40min。所述种子罐培养基重量组成为：麦芽糊精5-15％，酵母粉0.4-0.8％，中草药剂粉1.5-2％，海藻糖1-3％，蛋白胨0.1-0.5％，玉米浆0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，硫酸镁0.05-0.1％，柠檬酸钠0.1-0.5％，不足部分纯净水补足，pH值5.5-6.5，121-123℃灭菌30-40min。所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0x108个/ml；(3)发酵罐发酵方法①将步骤(2)中一级种子罐发酵液6-10％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间60-85h；溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5-6.5；方法②将步骤(2)中一级种子罐发酵液4-6％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间10-15h，然后以1.5-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养10-15h；继续以1.5-2℃/h降温速率缓慢降温至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中温α‑淀粉酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：枯草芽孢杆菌经斜面菌种活化和三级摇瓶种子培养及一级种子罐培养获得液体种子；将液体种子以以4‑6％接种量接入发酵罐，培养温度30‑37℃，搅拌速度200‑250r/min，通风量(V/V)1:1‑3,培养时间10‑15h；然后以1.5‑2℃/h降温速率缓慢降温至10‑15℃，恒温培养10‑15h；继续以1.5‑2℃/h降温速率缓慢降温至2‑5℃，此时，将一级种子罐发酵液以2‑4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10‑15h；最后以1.5‑2℃/h升温速率缓慢升至30‑37℃，恒温培养20‑40h；溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15‑30％；pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5‑6.5；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α‑淀粉酶。

【技术特征摘要】
1.一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：枯草芽孢杆菌经斜面菌种活化和三级摇瓶种子培养及一级种子罐培养获得液体种子；将液体种子以4-6％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间10-15h；然后以1.5-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养10-15h；继续以1.5-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将一级种子罐发酵液以2-4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；最后以1.5-2℃/h升温速率缓慢升至30-37℃，恒温培养20-40h；溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5-6.5；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶；所述枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌304Bacillussubtilis304，保藏号为CCTCCNO:M2013600。2.一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：枯草芽孢杆菌经斜面菌种活化和三级摇瓶种子培养及一级种子罐培养获得液体种子；将液体种子以6-10％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间60-85h；溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；pH控制通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5-6.5；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶；所述枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌304Bacillussubtilis304，保藏号为CCTCCNO:M2013600。3.根据权利要求1或2任意一项所述的一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，所述三级种子培养，其培养基重量组成为：酵母粉0.3-0.5％，葡萄糖1-1.5％，蛋白胨0.3-0.5％，牛肉膏0.5-0.8％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，中草药剂粉1.5-2％，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪兵，张锦杰，李海清，胡永明，朱永明，易继云，
申请(专利权)人：湖南新鸿鹰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43