一种用于检测人B淋巴瘤细胞的试剂盒制造技术

本发明专利技术描述了一种检测人B淋巴瘤细胞的试剂盒，试剂盒由纳米探针、蛋白质表达组分、磷酸缓冲液（PBS）、标准品和阴性对照品组成。本发明专利技术所述试剂盒的要点为纳米探针可以被人B淋巴瘤细胞特异性识别，释放质粒载体，质粒载体导入蛋白质表达组分生成绿色荧光蛋白（GFP），通过检测GFP的荧光信号从而计算人B淋巴瘤细胞的浓度。本试剂盒可用于定量分析人B淋巴瘤细胞和血清样品，操作简单、快速，准确性高，免标记，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术描述了一种检测人B淋巴瘤细胞的试剂盒，试剂盒由纳米探针、蛋白质表达组分、磷酸缓冲液（PBS）、标准品和阴性对照品组成。本专利技术所述试剂盒的要点为纳米探针可以被人B淋巴瘤细胞特异性识别，释放质粒载体，质粒载体导入蛋白质表达组分生成绿色荧光蛋白（GFP），通过检测GFP的荧光信号从而计算人B淋巴瘤细胞的浓度。本试剂盒可用于定量分析人B淋巴瘤细胞和血清样品，操作简单、快速，准确性高，免标记，具有良好的应用前景。【专利说明】一种用于检测人B淋巴瘤细胞的试剂盒
本专利技术涉及一种用于检测人B淋巴瘤细胞的试剂盒，属于体外肿瘤检测
。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的重大疾病。世界卫生组织的统计数据显示，近年来，全球平均每8个死亡病例中就有I人死于癌症，比艾滋病、结核病和疟疾导致的死亡人数总和还要高。有报告指出，按目前的医疗水平，对癌症患者早期治疗的5年生存率可超过80%，而对晚期癌症患者治疗后的5年生存率低于10%。因此，癌症的早期发现和早期诊断对癌症的预防和治疗具有极为重要的意义。 目前，癌症的临床诊断方法仍主要基于影像学检查组织和细胞形态，其分辨率较低，难以实现癌症的早期诊断。肿瘤细胞作为诊断肿瘤的一项重要指标，通过对恶性肿瘤细胞表面分化蛋白和细胞因子的检测可实现癌症的早期诊断与治疗，且对预后起到十分关键的作用。因此，设计可选择性识别肿瘤细胞的探针，建立特异性好、灵敏度高的肿瘤细胞检测新方法，对于癌症的预警和早期诊断具有重要的科学意义和临床价值。 近年来，仿生分子识别体系在分析化学领域显示出独特的优越性，其中以核酸适体和纳米生物探针的应用研宄最为广泛。核酸适体是采用指数富集配体系统进化法，从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到的能高亲和性、高特异性地与靶标分子折叠形成特定三维结构的单链寡核苷酸。利用核酸适体，可实现对细胞、生物大分子等生物靶标的选择性检测、定位及其生物功能的调控。 绿色荧光蛋白(GFP)由于在蓝色波长范围的光线激发下会发出绿色荧光，发光不需要其他协助因子，荧光生色团对热、PH、化学变性剂稳定，具有较强的抗光漂白，因而在众多研宄领域中得以广泛的应用。将GFP引入肿瘤检测系统，建立一种简便快速、特异性强、免标记的人B淋巴瘤细胞检测新方法，研制相应的检测试剂盒，对于人淋巴瘤的早期诊断具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便快速、特异性好、灵敏度高、免标记的人B淋巴瘤细胞检测试剂盒，试剂盒由纳米探针、蛋白质表达组分、磷酸缓冲液(PBS)、标准品和阴性对照品组成。 本专利技术通过以下技术方案来实现:(I)本专利技术提供一种检测人B淋巴瘤细胞的纳米探针，该探针以羧基磁珠为载体，负载一个分子信标，分子信标由人B淋巴瘤细胞适体脱氧核糖核酸-KDNA-1 )、脱氧核糖核酸-2(DNA-2)和质粒载体杂交组成。 (2)本专利技术提供一种蛋白质表达组分，该组分包括核糖核酸聚合酶、核苷三磷酸、核糖体、转运核糖核酸和氨基酸。质粒载体转入该蛋白质表达组分经转录、翻译可生成GFP。 (3)本专利技术提供一种标准品和一种阴性对照品，标准品是人B淋巴瘤细胞，阴性对照品是正常细胞293T。 (4)本专利技术提供一种GFP检测方法，利用荧光分光光度计对GFP进行定量分析，利用全内反射荧光显微技术对GFP进行成像分析。 本专利技术的有益效果:(I)准确性高:本专利技术的纳米探针负载人B淋巴瘤细胞的核酸适体，可以与人B淋巴瘤细胞特异性结合，因此试剂盒的特异性和准确性高。 (2)简单快速:只需将样本与纳米探针混合、磁性分离，取上清转化蛋白质表达组分，GFP的转录、翻译在蛋白质表达组分中一步即可完成，整个实验操作简单，耗时仅需3小时。 (3)免标记:GFP在特定波长下可以发出绿色荧光，该试剂盒无需引入标记分子即可对人B淋巴瘤细胞进行定性和定量分析，降低背景干扰，提高灵敏度。 【专利附图】【附图说明】 图1为本专利技术一个实施例中试剂盒的使用方法。 图2为本专利技术一个实施例中GFP荧光信号与人B淋巴瘤细胞浓度对数的线性关系图，横坐标是人B淋巴瘤细胞浓度的对数，纵坐标是相应浓度细胞时的GFP荧光强度(单位是 a.U.) ο 图3为本专利技术一个实施例中利用全内反射荧光显微技术对GFP的成像分析，A对应细胞浓度为O mL—1，B对应细胞浓度为100 mL—1，C对应细胞浓度为200 mL—1，标尺代表25μ m0 【具体实施方式】 以下为实施本专利技术的具体示例，其作用在于进一步阐明本专利技术的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本专利技术要求的保护范围的限定或限制。 实施例1:试剂盒的组成。 本实施例的人B淋巴瘤细胞检测试剂盒，包括纳米探针、蛋白质表达组分、PBS、标准品和阴性对照品。 纳米探针通过以下方式合成:取100 μ I羧基修饰磁珠，加入200 μ I咪唑-盐酸缓冲溶液(0.1 Μ)和100 μ I1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.2 M) 37°C反应40分钟以活化磁珠表面的羧基。加入10 μ?氨基修饰适体DNA-1 (100 yM)，37°C孵育过夜。用200 μ I PBS洗涤三次，磁性分离后，分散于I ml PBS中，于4°C条件下保存备用。 在上述复合物中加入10 μ I DNA-2 (100 μ Μ)，37°C孵育2小时，加入质粒载体10 μ 1、绑定剂(I mM) 10 μ 1，25°C反应I小时。得到的纳米探针磁性分离，用PBS洗涤三次，分散于I ml PBS中，于4°C条件下保存备用。 实施例2:结合图1，试剂盒的使用方法。 本实施例的人B淋巴瘤细胞检测试剂盒的具体检测步骤如下:1.样品处理:取I ml人B淋巴瘤细胞，离心，倾去上清液，用PBS洗涤后分散于PBS中，并对其进行梯度稀释，得到不同浓度的细胞样品。 2.探针与样品孵育:分别取25 μ I纳米探针、25 μ I不同浓度的细胞样品，37°C孵育I小时，磁性分离，将上清液转移至一新管中。 3.合成GFP:取5 μ I上清液与蛋白质表达组分混合，37°C反应I小时。 4.GFP检测:用荧光分光光度计检测GFP的荧光信号，用全内反射荧光显微技术对GFP进行成像分析。 实施例3:结合图2，加入不同浓度人B淋巴瘤细胞产生的GFP荧光信号图。 取不同浓度的人8淋巴瘤细胞(0，500，103，104，105，106 ι?Γ1)加入反应体系，结果发现，随细胞浓度的降低，GFP荧光信号强度逐渐降低，在500 ~ 16 ml/1浓度范围内，荧光信号与细胞浓度的对数值成正比，绘制标准曲线。 实施例4:结合图3，通过GFP成像检测人B淋巴瘤细胞。 进一步降低人B淋巴瘤细胞的浓度至200 mL'100 mL—1，反应后利用全内反射荧光显微技术观察，可以看到GFP的荧光，且信号强度与细胞浓度呈正相关。 实施例5:利用试剂盒进行血清样品检测。 取人淋巴瘤血清样品，离心，用PBS洗涤后分散于PBS中，利用该试剂盒进行检测，通过荧光分光光度计检测GFP信号，对比图1的标准曲线从而计算血清中的人B淋巴瘤细胞浓度。【权利要求】1.一种用于检测人B淋巴瘤细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测人B淋巴瘤细胞的试剂盒，包括纳米探针、蛋白质表达组分、磷酸缓冲液（PBS）、标准品和阴性对照，其特征在于可以定量分析人B淋巴瘤细胞和血清样品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郗冬梅，张书圣，时鹏飞，王新栋，修宝，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37