一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法。该方法为将微生物菌悬浮液中加入含有四甲基联苯胺和过氧化氢的显色液，使显色反应充分进行；再加入硫酸溶液终止显色反应，将蓝色转变为黄色，用酶标仪检测其OD450nm值，该OD值即为微生物样品的胞外呼吸活性值。本发明专利技术方法操作简单、迅速，最快3min可得检测结果，可用于微生物样品的快速检测；且具有很好的特异性，检测结果几乎不受其他常见微生物的影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物检测领域，涉及。
技术介绍
微生物胞外呼吸是指在厌氧条件下微生物在胞内氧化有机物释放电子，并且偶联 呼吸链将产生的电子传递到胞外受体使其还原的过程。能够接受其电子而被还原的胞外受 体种类繁多，包括水溶性的铀，金和银离子，硫酸盐，铁锰矿物和腐殖质等。此外，人造电极 也能够接受胞外呼吸过程传递到胞外的电子，从而产生电流。因此，微生物胞外呼吸具有重 要的应用价值，在污染物原位修复、污水处理、微生物冶炼、微生物合成及微生物产电等方 面表现出重要的应用前景。鉴于胞外呼吸广泛的应用前景，开发低成本快速检测微生物胞 外呼吸活性的方法具有重要意义。目前，针对微生物胞外呼吸活性的检测方法，有异化铁还 原法，腐殖质还原法和生物电流法。然而，这些方法操作程序复杂而且耗用时间长。 微生物自身携带的酶催化显色反应是进行微生物活性检测的有效方法。在胞外呼 吸过程中，微生物氧化有机物产生的电子必须通过复杂电子传递网络传递到达细胞外膜， 然后通过外膜上的多血红素细胞色素c传递到胞外。已有研究表明，胞外呼吸菌80%的膜 结合的c型细胞色素位于细胞外膜，而且这些c型细胞色素与辣根过氧化物酶具有铁卟啉 结构，因此具有相似的过氧化氢酶活性。对现有的技术检索发现，目前还没针对微生物胞外 酶开发的检测胞外呼吸活性的方法。因此，利用胞外呼吸菌外膜细胞色素c的过氧化氢酶 活性，结合微孔板快速检测技术，可以开发出一种新型微生物胞外呼吸活性快速检测方法。
技术实现思路
针对现有技术中所存在的不足，本专利技术通过研究将微生物外膜细胞色素C过氧化 氢酶活性的信号放大作用与微孔板快速检测系统相结合，构建了一种快速检测微生物胞外 呼吸活性的方法。该方法具有可靠性高，操作简单，检测迅速。 本专利技术的目的在于提供。 本专利技术所采取的技术方案是： ，包括以下操作步骤： 1) 将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应； 所述显色液含有柠檬酸钠、磷酸氢二钠、四甲基联苯胺和过氧化氢，pH为4?5 ; 2) 往上一步的反应液中加入终止液以终止显色反应，然后检测反应液在450nm处的0D 值； 3) 结果分析：〇D45(tam值越大说明待测微生物胞外呼吸活性越强。 进一步的，上述微生物菌悬液中微生物浓度不小于2X108cfu/ml。 进一步的，上述微生物菌悬液中的液体为生理盐水或HEPES缓冲液。 进一步的，上述显色液的体积为微生物菌悬液的0. 8?1. 2倍。 进一步的，上述显色液含有80?120mM柠檬酸钠，180?220mM磷酸氢二钠，0. 3? 0? 35mM四甲基联苯胺和1. 8?2. 2mM过氧化氢，pH为4?5。 进一步的，上述显色液含有lOOmM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0. 32mM四甲基联 苯胺和2mM过氧化氢，pH为4. 3。 进一步的，上述显色反应时间为15?25min，温度为18?27°C。 进一步的，上述终止液的体积为显色液体积的0. 4?0. 6倍。 进一步的，上述终止液为硫酸溶液。 进一步的，上述终止液为1. 8?2. 2M硫酸溶液。 本专利技术的有益效果是： (1) 细胞色素c是胞外呼吸菌的关键酶，具有较强的过氧化氢酶活性，能够快速催化过 氧化氢快速氧化四甲基联苯胺产生蓝色产物，最快3分钟即可获得检测结果； (2) 本专利技术方法可采用微孔板检测，能够实现对多个样品同时进行微量、批量、快速地 检测； (3) 本专利技术所述的微生物胞外呼吸活性的检测方法可靠性高，其检测结果与传统的异 化铁还原法和生物电流法结果一致。 【附图说明】 图1为快速检测微生物胞外呼吸活性的示意图； 图2为各微生物中胞外细胞色素c的漫反射光谱图及含量，A为漫反射光谱图，B为胞 外细胞色素c的含量； 图3为异化铁还原法和生物电流法检测各微生物胞外呼吸活性结果图；A和B为异化 铁还原法检测各微生物胞外呼吸活性结果，C为生物电流法检测的结果； 图4为实施例2检测各微生物胞外呼吸活性的结果； 图5为快速检测法与传统方法的相关分析； 图6为快速检测方法的特异性结果。 【具体实施方式】 ，包括以下操作步骤： 1) 将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应； 所述显色液含有柠檬酸钠、磷酸氢二钠、四甲基联苯胺和过氧化氢，pH为4?5; 2) 往上一步的反应液中加入终止液以终止显色反应，然后检测反应液在450nm处的0D 值； 3)结果分析：〇D45(tam值越大说明待测微生物胞外呼吸活性越强。 优选的，上述微生物菌悬液中微生物浓度不小2X108cfu/ml。 优选的，上述微生物菌悬液中的液体为生理盐水或HEPES缓冲液。。 优选的，上述显色液的体积为微生物菌悬液的0. 8?1. 2倍。 优选的，上述显色液含有80?120mM柠檬酸钠，180?220mM磷酸氢二钠，0. 3? 0. 35mM四甲基联苯胺和1. 8?2. 2mM过氧化氢，pH为4?5。 最优选的，上述显色液含有lOOmM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0. 32mM四甲基联 苯胺和2mM过氧化氢，pH为4. 3。 优选的，上述显色反应时间为15?25min，温度为18?27°C。 优选的，上述终止液的体积为显色液体积的0. 4?0. 6倍。 优选的，上述终止液为硫酸溶液。 更优选的，上述终止液为1. 8?2. 2M硫酸溶液。 下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。 实施例1:微生物细胞色素c漫反射光谱扫描 (1)微生物悬浮液的制备 将微生物保存液以1:50比例接种于含有5ml无菌LB培养基的试管中，在30°C，转速 180rpm振荡培养至对数生长期；将培养菌液以7000g离心5min，倒去上清液收集沉淀，以 HEPES缓冲液洗涤3遍；以HEPES缓冲液将菌液浓度调至0D600为0. 5左右（约2. 5X108 CFU/mL)，4°C保存待用。 (2)漫反射光谱扫描 取lcm光径、lml容积石英比色皿，以lmlHEPES缓冲液为空白，校正积分球紫外的漫 反射吸收光谱；将ffiPES缓冲液换为微生物菌悬液，记录波长范围300-700nm的漫反射吸 收光谱。根据Kubelka-Munk方程F(R) = (1-R…）V(2R…）=K/S计算微生物细胞色素c含 量。 实施例2:快速检测微生物胞外呼吸活性的方法 快速检测微生物MR-1, SP200, Shewanella decolorationisS12,Pantoea agglomeransMFC-3,Aeromonas hydrophilaHS01,Comamonas guandongensisCY01,Pseudomonas aeruginosaPAH-1,Fontibacter ferrireducensSgZ-2，Thauera humireducensSgZ-1，Escherichia coliK12 矛口 DMS10)胞外呼吸活性方法的示意图如图1所示，具体操作步骤为： 1) 在96微孔板中加入100iiL按实施例1所述方法制备得到上述各微生物的菌悬液； 2) 再在上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：1）将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应；所述显色液含有柠檬酸钠、磷酸氢二钠、四甲基联苯胺和过氧化氢，pH为4～5；2）往上一步的反应液中加入终止液以终止显色反应，然后检测反应液在450nm处的OD值；3）结果分析：OD450nm值越大说明待测微生物胞外呼吸活性越强。

【技术特征摘要】
1. 一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法，其特征在于：包括以下操作步骤： 1) 将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应； 所述显色液含有柠檬酸钠、磷酸氢二钠、四甲基联苯胺和过氧化氢，pH为4?5 ; 2) 往上一步的反应液中加入终止液以终止显色反应，然后检测反应液在450nm处的0D 值； 3) 结果分析：〇D45(tam值越大说明待测微生物胞外呼吸活性越强。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微生物菌悬液中微生物浓度不小 于 2X108 cfu/ml。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微生物菌悬液中的液体为生理盐 水或HEPES缓冲液。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述显色液的体积为微生物菌悬液的 0? 8 ?1. 2 倍。5. 根据权利要求1或4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：温俊林，周顺桂，陈俊华，陆琴，
申请(专利权)人：广东省生态环境与土壤研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44