一种hMPV定量分型检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及hMPV定量分型检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒中引物组包括A亚型hMPV引物组和B亚型hMPV引物组；A亚型hMPV引物组由SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物和SEQ ID NO：3所示的探针组成；B亚型hMPV引物组由SEQ ID NO：4所示的上游引物、SEQ ID NO：5所示的下游引物和SEQ ID NO：6所示的探针组成。通过研究证明，本发明专利技术的引物组的特异性强、灵敏度高，可用于A亚型hMPV和B亚型hMPV的有效扩增，从而可实现hMPV的准确定量与分型；并同时获得定量和分型结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种hMPV定量分型检测试剂盒及其检测方 法。
技术介绍
人类偏肺病毒（Human Metapneumovirus，hMPV)为荷兰学者于2001年首次在儿童 呼吸道感染标本中分离得到的一种新的呼吸道病原体。该病毒基因组全长约13550nt，根据 其序列的不同可以分成A、B两个基因型。该病毒可导致人的上下呼吸道感染，其临床特征 类似于RSV(呼吸道合胞病毒），主要症状包括咳嗽、咽痛、呼吸困难、缺氧、喘息等。自人类 偏肺病毒发现以来，亚洲、北美洲、欧洲、南美洲、非洲、大洋洲均有其感染的流行病学报告， 呈现全球流行趋势。在中国重庆和北京也有关于hMPV感染的报道。血清学研究表明hMPV 已经在人群流行50年以上，大多数人在5岁时均已感染过hMPV。4?10. 8 %的呼吸道感 染住院患儿同hMPV有关。hMPV还是引起老人和免疫缺陷患者严重呼吸道感染疾病的常见 病原体，并可同其他一些病原体合并感染，如RSV，SARS-C〇V(严重急性呼吸综合征冠状病 毒）。由此可见，hMPV是一种常见的呼吸道病原体，建立准确的检测手段对于其早期诊断和 治疗具有重要意义。 目前，检测hMPV的方法主要包括Sanger法、普通荧光定量PCR法和液相芯片法。 其中，Sanger法是指针对同一个标本，需借助病毒A、B亚型的特异性引物，分别进行PCR才 能进行病毒基因分型鉴定，不仅造成珍贵临床资源的浪费，而且耗时耗力增加检测成本；普 通荧光定量PCR法虽可进行病毒定量检测，但不能同时进行病毒分型鉴定；液相芯片法检 测快速、灵敏，但须积累标本至足够数量后才能进行检测，不能满足临床标本随时检测的需 要，并且需配置专门的仪器软件等，检测价格昂贵。 由于不同基因型感染后疾病的严重程度不同，预后也不同，所以了解基因型对于 治疗有重要指导意义。针对上述方法存在的不足，急需开发一种能够同时进行病毒分型鉴 定及定量检测的方法，为临床治疗方案的调整以及预后评估等提供依据。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了。本专利技术提 供的引物组的特异性强、灵敏度高，可用于A亚型hMPV和B亚型hMPV的有效扩增，从而可 实现hMPV的准确定量与分型；本专利技术提供的hMPV定量分型检测试剂盒定量准确，可以准确 定量检测病毒核酸；灵敏度及特异性高；检测速度快，仅1小时，加上核酸的提取和逆转录， 共仅需3?4小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。本专利技术适用于人类偏肺病毒 的临床或实验室定量及定性检测，人类偏肺病毒感染的早期诊断，监视和预测人类偏肺病 毒流行性，以及对疗效进行监测和评估。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案： 本专利技术提供了用于扩增hMPV基因片段的引物组，包括A亚型hMPV引物组和B亚 型hMPV引物组； A亚型hMPV引物组由SEQ ID NO :1所示的上游引物、SEQ ID NO :2所示的下游引 物和SEQ ID NO : 3所示的探针组成； B亚型hMPV引物组由SEQ ID NO :4所示的上游引物、SEQ ID NO :5所示的下游引 物和SEQ ID NO :6所示的探针组成。 在本专利技术中，A亚型hMPV引物组是根据A亚型标准株NL/l/00(accession number:AF371337)设计得来，B亚型hMPV引物组是根据B亚型标准株NL/1/99 (accession number :AF525843)设计得来。 通过研究，本专利技术提供的引物组的特异性强、灵敏度高，可用于A亚型hMPV和B亚 型hMPV的有效扩增，从而实现hMPV的准确定量与分型。 本专利技术提供的引物组在制备hMPV定量分型检测试剂盒中的应用；该引物组包括A 亚型hMPV引物组和B亚型hMPV引物组；A亚型hMPV引物组由SEQ ID NO :1所示的上游引 物、SEQ ID NO :2所示的下游引物和SEQ ID NO :3所示的探针组成；B亚型hMPV引物组由 SEQ ID NO :4所示的上游引物、SEQ ID NO :5所示的下游引物和SEQ ID NO :6所示的探针 组成。 在本专利技术提供的一些实施例中，hMPV为A亚型hMPV和/或B亚型hMPV。 本专利技术还提供了一种hMPV定量分型检测试剂盒，包括标准阳性模板、荧光定量反 应液和本专利技术提供的引物组；该引物组包括A亚型hMPV引物组和B亚型hMPV引物组；A亚 型hMPV引物组由SEQ ID NO :1所示的上游引物、SEQ ID NO :2所示的下游引物和SEQ ID NO :3所示的探针组成；B亚型hMPV引物组由SEQ ID NO :4所示的上游引物、SEQ ID NO :5 所示的下游引物和SEQ ID NO :6所示的探针组成。 在本专利技术提供的一些实施例中，标准阳性模板为：插入人类偏肺病毒A亚型F基因 1620个核苷酸特异序列的pMD18-T载体质粒，和插入人类偏肺病毒B亚型F基因1620个核 苷酸特异序列的PMD18-T载体质粒。 在本专利技术提供的一些实施例中，标准阳性模板的浓度为IX IOltl拷贝/i! L，容积为 125 ii L 至 500 ii L，保存条件为-20°C。 人类偏肺病毒A亚型F基因1620个核苷酸序列如SEQ ID NO :7所示。 人类偏肺病毒B亚型F基因1620个核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示。 作为优选，本专利技术提供的试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂、阳性参控品或 阴性参控品中的一种或几种。 在本专利技术提供的一些实施例中，阳性参控品为：感染人类偏肺病毒标准株的 Ver〇-E6细胞株提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA。其包括：人类偏肺病毒A亚型标准株 感染Ver〇-E6细胞株后，提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA ;和人类偏肺病毒B亚型标准 株感染Ver〇-E6细胞株后，提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA。 阳性参控品的容积为100 U L至400 i! L，保存条件为-20°c。 在本专利技术提供的一些实施例中，阴性参控品为水。 在本专利技术提供的一些实施例中，荧光定量反应液包括缓冲液、dNTPs、染料和DNA 聚合酶。 在本专利技术提供的一些实施例中，荧光定量反应液的容积为625 ii L至2500 ii L，保 存条件为_2〇°C。 本专利技术中引物的浓度为IOy M，容积为25 ii L至IOOii L，保存条件为-20°C。 本专利技术中荧光探针的5'端标记分别为：基因型A(A亚型）的荧光报告基团为 FAM(羧基荧光素）-BHQ-l，基因型B(B亚型）的荧光报告基团为HEX(氯荧光素氨基磷酸 酯）-BHQ-I。 本专利技术中荧光探针的3'端标记的荧光受体基因为Eclipse淬灭基团。 本专利技术中荧光探针的容积为50 ii L至200 ii L，保存条件为-20°C。 本专利技术还提供了一种非诊断目的hMPV定量分型检测的方法，包括如下步骤： 将标准阳性模板进行倍比稀释，获得标准稀释液；取荧光定量反应液、标准稀释液 和本专利技术提供的引物组进行荧光定量PCR，绘制标本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于扩增hMPV基因片段的引物组，其特征在于，包括A亚型hMPV引物组和B亚型hMPV引物组；所述A亚型hMPV引物组由SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物和SEQ ID NO：3所示的探针组成；所述B亚型hMPV引物组由SEQ ID NO：4所示的上游引物、SEQ ID NO：5所示的下游引物和SEQ ID NO：6所示的探针组成。

【技术特征摘要】
1. 用于扩增hMPV基因片段的引物组，其特征在于，包括A亚型hMPV引物组和B亚型 hMPV引物组； 所述A亚型hMPV引物组由SEQ ID NO :1所示的上游引物、SEQ ID NO :2所示的下游引 物和SEQ ID NO : 3所示的探针组成； 所述B亚型hMPV引物组由SEQ ID NO :4所示的上游引物、SEQ ID NO :5所示的下游引 物和SEQ ID NO :6所示的探针组成。2. 如权利要求1所述的引物组在制备hMPV定量分型检测试剂盒中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述hMPV为A亚型hMPV和/或B亚型 hMPV。4. 一种hMPV定量分型检测试剂盒，其特征在于，包括标准阳性模板、荧光定量反应液 和如权利要求1所述的引物组。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性模板为：插入A亚型人类 偏肺病毒F基因1620个核苷酸特异序列的pMD18-T载体质粒，和插入B亚型人类偏肺病毒 F基因1620个核苷酸特异序列的pMD18-T载体质粒。6. 根据权利要求4所述的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵耀，赵晓东，杨晖，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85