一种制备花生四烯酸的方法，涉及花生四烯酸。对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，在基础培养基分批发酵，在优化培养基中以酵母粉和玉米浆为氮源分批发酵，再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，对高山被孢霉进行高糖驯化及对驯化后的菌种在混合氮源优化培养基中进行2L分批发酵，在2L发酵罐中装入混合氮源优化培养基，在当葡萄糖浓度降至10g/L时，流加600g/L葡萄糖，使残糖控制在10g/L，培养168h后开始收获干菌体、油脂和ARA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及花生四烯酸，尤其是涉及。
技术介绍
花生四稀酸（Arachidonic Acid，简称ARA，即5,8,11，14-二十碳四稀酸）属于 ?-6系列长链多不饱和脂肪酸，由于人体内不具备相应的酶系统来合成特定的不饱和双 键，因此被认为是人体必需脂肪酸，是许多二十碳衍生物如前列腺素E 2(PGE2)、前列环素 (PGI2)、血栓烷 A2(TXA2)、白三烯 Leukotirene B4(LTB4)*C4(LTC4)的直接前体。ARA 还具 有调节体内多种离子通道作用，控制细胞膜的通透性，维持机体保水性等许多重要的生理 功能。同时研宄表明，花生四烯酸对婴儿的大脑发育和视觉功能的完善有着极为重要的意 义，花生四烯酸对高血压、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的预防与治疗也有显著的效果 (Roger et al. Biotechnology Bioengineering，2010, 9 (20): 245-257)。因此，花生四稀酸 既是一种营养强化剂，又是人类重要的保健品。ARA作为人体必需脂肪酸发挥着无可替代的 作用，应用前景广阔。 ARA主要来源有植物、动物组织、鱼油以及微生物和微藻类等，但ARA在动物组织 中含量低，来源也有限，而微生物发酵法则为生产ARA开辟了新途径，它具有不受原材料及 气候限制、生长周期短、培养工艺简单、ARA含量高等特点，近年来已成为国内外研宄的热 点。国际上开展产多不饱和脂肪酸（PFUAs)的微生物研宄主要集中在以下几个方面：（1)产 PFUAs菌种的分离与选育；（2)培养条件及发酵工艺的优化；（3)培养方式的研宄（包括批 式、补料、连续培养工艺等）；(4) PFUAs的分离纯化及结构鉴定。目前，人们仅发现接合菌纲 是比较具有研宄价值的的一个纲，而且普遍看好被孢霉，认为它是生产ARA、EPA、DHA最有 潜力的菌种。目前，日本、美国等国家已经先后问世了 ARA的发酵产品，国内在这一领域的 研宄起步晚，虽对微生物发酵生产ARA方面作了一些研宄，但还存在着生物量偏低，油脂含 量较低等问题，离大规模的工业化生产仍有一定的距离。 中国专利CN101613724公开一种利用高山被孢霉菌丝体制备花生四烯酸的方法， 包括有下述步骤：首先在恒温摇床中将高山被孢霉接种量的深层培养；再转接于装有发酵 培养基的器皿中，培养后获得发酵醪液，其中生长培养基或/和发酵培养基的氮源以高山 被孢霉菌柏代替部分常用氮源，高山被孢霉菌柏中的氮源替代比以质量百分比计为10%? 90% ;发酵醪液经过滤，收集的霉菌生物体，经洗涤、干燥、粉碎，采用非极性溶剂进行浸提 或压榨，收获油脂，收获的油脂经进一步处理获得目标产品，霉菌生物体经非极性溶剂浸提 后剩余固体物质，即为可循环使用的高山被孢霉菌柏，该专利技术利用高山被孢霉发酵生产花 生四烯酸过程中产生的废弃物得到循环利用，避免了环境污染物的排放。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。 本专利技术包括以下步骤： 1)通过摇瓶实验对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，所述优化的方法为取 4mL种子液接入装有50mL基础培养基（葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ;MgS04-7H20 0. lg/L ; KH2P040. 5g/L ;CaC030. 05g/L ;ZnS04-7H20 0? lg/L ;pH 6. 0)的 250mL 三角瓶，28 °C、150rpm 培养5?6d，得到优化培养基：葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米浆lOg/L ;谷氨酸1. Og/L ; MgS04-7H200. lg/L ;KH2P042. Og/L ;CaC030 . 05g/L ;ZnS04-7H20 0? lg/L ;混合微量元素 lmL/L ; 混合维生素lmL/L ;pH调至6. 0 ; 2)对高山被孢霉进行高糖驯化及对驯化后的菌种在混合氮源优化培养基中进行 2L分批发酵，在2L发酵罐中装入混合氮源优化培养基，在当葡萄糖浓度降至10g/L时，流加 600g/L葡萄糖，使残糖控制在10g/L，培养168h后开始收获干菌体、油脂和ARA。 在步骤1)中，所述混合微量元素可包括FeCl3 ? 6H20,、H3B03、MnCl2 ? 4H20、 CoC12 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、NiS04 ? 6H20等；所述混合维生素可包括维生素B12、生物素、维生 素&、泛酸钙等。 在步骤2)中，所述2L分批发酵的具体方法可为：首先采用固体培养基驯化，将菌 种逐级涂布于梯度高糖平板（含糖量分别为2%、5%、7%、10%和15%)培养，挑选经固体 驯化后能耐受10%高糖浓度平板的菌种转接到两种含不同氮源的梯度高糖（含糖量分别 为3%、4%、5%和6%)液体培养基中进行驯化，接着对该驯化后的菌种，使用步骤2)中所 述的混合氮源优化培养基进行分批发酵；所述干菌体可得58g/L，油脂可得28g/L，ARA可得 16g/L〇 所述高山被孢霉可以接种适量的被孢霉至载有培养基的摇瓶中，置于摇床上培 养，转速为100?300rpm，较好的为150?200rpm。 本专利技术涉及的培养基的组成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用 蔗糖、麦芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是较适宜的碳源，来源简单，价格低廉，使用量为30? 80g/L。对于摇瓶种子培养，一般将使用量降低至10?30g/L，可根据培养的时间及所要求 的生物量密度来选择用量。具体合适的用量选择，本领域的技术人员可以通过相关操作确 定碳源的种类及合适用量。同时，可视微生物的生长情况，选择一次性加入全部碳源或者分 批补入。氮源可以选择酵母粉、玉米浆、蛋白胨、大豆粉等中的至少一种，酵母粉或者玉米浆 被认为是比较好的氮源，添加浓度在5?15g/L，本领域的技术人员可以通过相关实验操作 确定氮源的种类及用量。 可选择使用单一氮源或混合氮源，更好的结果是使用混合氮源（玉米浆、酵母粉） 为发酵罐培养的适宜氮源，且二者的质量比例对于油脂的积累影响较大，可利用响应面分 析等统计方法进一步优化碳氮源的组合，较好的两种氮源比例为3:8 (w/w)。 温度低于20°C高山被孢霉将会开始大量产生EPA，而培养要求得到较高含量的 ARA，同时尽量减低或避免产生EPA，培养温度通常保持在25?30°C。微生物发酵生产 PUFAs，其最高产量一般是在对数期后期或稳定期前期，因此要在最短的时间内获得最大可 能的生物量及总脂肪酸的含量，一般来说，最适收获ARA的时间是在第5?6天。 真菌生长的pH范围较广，更偏好于在偏酸环境中生长，pH在4. 0至8. 0之间均可 以正常生长，本专利技术的实施过程中发现，初始pH 6. 0?6. 5,培养过程中pH在7?8之间有 利于ARA的积累；pH 4?5之间有利于生物量的积累，在培养过程中可分阶段的调节pH水 平以适应所要求的生长环境。 接种量可以在2%至14% (V/V)，接种量低，生物量达不到所要求的水平，接种量 高，在生物量积累到一定程度将会抑制菌体的继续生长，在摇瓶培养中，接种控制在3%? 5% (V/V)，而在发酵罐培养中，接本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备花生四烯酸的方法，其特征在于包括以下步骤：1)通过摇瓶实验对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，所述优化的方法为取4mL种子液接入装有50mL基础培养基的250mL三角瓶，28℃、150rpm培养5～6d，得到优化培养基：葡萄糖60g/L；酵母粉或玉米浆10g/L；谷氨酸1.0g/L；MgSO4‑7H2O0.1g/L；KH2PO42.0g/L；CaCO30.05g/L；ZnSO4‑7H2O 0.1g/L；混合微量元素1mL/L；混合维生素1mL/L；pH调至6.0；所述基础培养基的组成为葡萄糖40g/L；酵母粉5g/L；MgSO4‑7H2O 0.1g/L；KH2PO40.5g/L；CaCO30.05g/L；ZnSO4‑7H2O 0.1g/L；pH 6.0；2)对高山被孢霉进行高糖驯化及对驯化后的菌种在混合氮源优化培养基中进行2L分批发酵，在2L发酵罐中装入混合氮源优化培养基，在当葡萄糖浓度降至10g/L时，流加600g/L葡萄糖，使残糖控制在10g/L，培养168h后开始收获干菌体、油脂和ARA。
【技术特征摘要】
1. 一种制备花生四烯酸的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 通过摇瓶实验对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，所述优化的方法为取 4mL种子液接入装有50mL基础培养基的250mL三角瓶，28°C、150rpm培养5?6d，得到 优化培养基：葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米浆10g/L ;谷氨酸1. Og/L ;MgS04-7H200. lg/L ; KH2P042. Og/L ;CaC030. 05g/L ;ZnS04-7H20 0? lg/L ;混合微量元素 lmL/L ;混合维生素 lmL/ L ;pH调至6. 0 ;所述基础培养基的组成为葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ;MgS04-7H20 0. lg/L ; KH2P040. 5g/L ；CaC030. 05g/L ；ZnS04-7H20 0. lg/L ；pH 6. 0 ； 2) 对高山被孢霉进行高糖驯化及对驯化后的菌种在混合氮源优化培养基中进行2L 分批发酵，在2L发酵罐中装入混合氮源优化培养基，在当葡萄糖浓度降至10g/L时，流加 600g/L葡萄糖，使残糖控制在10g...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢英华，曾思钰，凌雪萍，敬科举，吴意珣，陈翠雪，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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