分泌抗番茄斑萎病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用差速离心的方法提纯的番茄斑萎病毒病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，保藏号为CGMCCNo.9343。杂交瘤细胞分泌的单抗腹水ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。1A5分泌的单抗仅与番茄斑萎病毒有特异性反应，与芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、鸢尾黄斑病毒、黄瓜花叶病毒等不反应。且该单抗能特异和灵敏地检测番茄斑萎病毒。该杂交瘤细胞株及其分泌的单抗为该番茄病毒病的诊断、检测及科学防控提供技术和物质支撑。

【技术实现步骤摘要】
分泌抗番茄斑萎病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）是一种危害农业生产的重要病毒。它的寄主范围很广，可侵害160种双子叶植物与10种单子叶植物，尤其是茄科、菊科和豆科的部分植物。在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋洲等多个国家和地区广泛分布，热带、亚热带、温带地区均有发生。属于欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）A2类检疫性有害生物，同时也是中国进境植物检疫性有害生物。番茄斑萎病毒最初是1919年在澳洲发现于番茄，Brillelebank将此病命名为斑萎病。TSWV在世界上温带和亚热带地区比较常见。1941年前后TSWV成为影响欧洲烟草种植者经济收入的一种重要病毒。TSWV在巴西东南部也广泛流行。病毒粒体扁球状，直径80～96纳米，易变形，具包膜，存在于内质网和核膜腔里，有的具尾状挤出物，质粒含20%类脂，7%碳水化合物，5%RNA。致死温度40～46℃，10分钟；稀释限点100～1000倍，体外存活期3～4小时。传播途径广泛，汁液可接种，种子也能传染，此外烟蓟马(Thripstabaci)、豆蓟马(T．Setosus)、蓟马(Frankliniellaschutzei)、烟草褐蓟马(F．Fusca)及苜蓿蓟马(F．Occidentatis)等均可进行持久性传毒。蓟马只能在幼虫期获得病毒。传毒需要在体内繁殖，葱蓟马经5～10天变为成虫后才能传毒，烟蓟马最短获毒期为15～30分钟，豆蓟马需30分钟，时间长传毒效率升高，蓟马一旦带毒，传毒达20天，具终生传毒能力。病毒接种多在番茄叶表细胞浅表皮吸食时获取，一般经4天潜育即发病。番茄、瓜叶菊等外种皮带毒，不进入胚胎。该病症状变化大。苗期染病，幼叶变为铜色上卷，后形成许多小黑斑，叶背面沿脉呈紫色，有的生长点死掉，茎端形成褐色坏死条斑，病株仅半边生长或完全矮化或落叶呈萎蔫状，发病早的不结果。坐果后染病，果实上出现褪绿环斑，绿果略凸起，轮纹不明显，青果上产生褐色坏死斑，呈瘤状突起，果实易脱落。成熟果实染病轮纹明显，红黄或红白相间，褪绿斑在全色期明显，严重的全果僵缩，脐部症状与脐腐病相似，但该病果实表皮变褐坏死别于脐腐病。此病毒可以通过一些野生植物品种来越冬。但是，病毒流行水平主要依赖于虫口密度。最主要的介体昆虫蓟马的成虫藏在土壤中，春季土壤温度上升后，害虫会迁移到杂草上。目前尚未育出抗TSWV的专用品种，防治困难。针对抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的制备展开工作。当前监测体系尚不完善，甚至主要流行区也未开展相关预测预报的工作。目前用来检测这种病毒的方法主要是田间观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法。这几种方法都具有其局限性，而且不适合大批量的田间样品检测。而血清学的方法适用于田间样品批量检测，但必须依赖于特异性的病毒单抗。以番茄斑萎病毒提纯病毒粒子为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗TSWV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞1A5，以其分泌的单抗为核心建立了检测TSWV的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并成功应用于田间植物样品中番茄斑萎病毒的检测，从而为我国番茄斑萎病的诊断、早期监测和预警、科学指导防控提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，它能分泌抗番茄斑萎病毒的特异性单克隆抗体,杂交瘤细胞株1A5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9343；抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体腹水的ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释；抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体仅与番茄斑萎病毒有特异性反应，而不与鸢尾黄斑病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反应抗番茄斑萎病毒(TSWV)单克隆抗体在该病毒检测及检疫上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株分泌抗番茄斑萎病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测番茄斑萎病毒；2）利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测番茄斑萎病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本专利技术所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间蔬菜作物中的番茄斑萎病毒的检测、诊断。附图说明图1是dot-ELISA方法检测番茄斑萎病毒的灵敏度分析；图2是dot-ELISA方法检测田间植物样品中番茄斑萎病毒的结果。具体实施方式分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，它能分泌抗番茄斑萎病毒的特异性单克隆抗体,杂交瘤细胞株1A5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.9343；抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体腹水的ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释；抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体仅与番茄斑萎病毒有特异性反应，而不与鸢尾黄斑病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反应抗番茄斑萎病毒(TSWV)单克隆抗体在该病毒检测及检疫上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗番茄斑萎病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测TSWV的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并可应用于田间作物中TSWV含量的检测，从而为我国番茄斑萎病毒的检测、检疫、早期监测和预警、科学防控提供物质和技术支持。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明。一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备1.免疫原及检测抗原的制备1)将大研钵和组织搅拌器预冷；2)称取500g本氏烟病叶，每100g病叶中加入pH7.5的0.5M磷酸盐缓冲液(即PB缓冲液）200ml（含0.01MNa-EDTA和0.1%巯基乙醇），匀浆2分钟后用双层尼龙纱布过滤，滤液离心（6000r/min,20min）去植物组织残渣；3)所得上清液边搅拌边滴加2.5%TritonX-100,4%PEG（分子量为6000）和0.1mol/LNaCl,4℃搅拌4h以上；4)离心（11000r/min,15min）得沉淀；5)沉淀用pH7.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，其特征在于能分泌抗番茄斑萎病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株1A5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9343。

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗番茄斑萎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A5，其特征在于能分泌抗番茄斑萎病毒的特异性单克隆抗体,杂交瘤细胞株1A5于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9343。2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株1A5分泌的抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释。3.一种如权利要求2所述的杂交瘤细胞株1A5分泌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，谢艳，李娜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33