一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用技术

本发明专利技术提供一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用。现有技术中，虽然有报道如何提高菌株中DHA含量，但往往考虑因素单一，并未综合探索如何大幅提高菌株中DHA含量，这也是裂殖壶菌实现产业化的关键所在。本发明专利技术利用离子束诱变方法得到裂殖壶菌TC5-2，同时结合培养基和发酵工艺的优化，并添加外源因子烯草酮，大幅提高菌株中DHA含量，有利于实现裂殖壶菌生产DHA的产业化。

【技术实现步骤摘要】
一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用
本专利技术属于微生物发酵领域，涉及一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用。
技术介绍
二十二碳六烯酸（DocosahexaenoicAcid，DHA)是哺乳动物生长所必需的多不饱 和脂肪酸的一种，但由于需从外界摄取，因而被称为必需脂肪酸。研究表明，DHA对婴幼儿 大脑和视力发育具有非常重要的生理作用，并具有预防及治疗心血管疾病、防治老年痴呆、 抑制癌变等生理功能，因而广泛用于食品、医药和饲料行业。 DHA的传统来源为深海鱼油，但存在率低、资源有限和纯化工艺复杂等缺陷。海洋 微生物被认为是DHA最有前途的商业化来源，其中利用微藻(包括隐甲藻、真菌如裂殖壶菌 和破囊壶菌等）培养生产DHA具有更大的优势和生产潜能，但普遍存在发酵藻粉产率低、月旨 肪酸中DHA含量不够高的缺陷。微藻中裂殖壶菌发酵生产DHA的含量相对比较高，因此也 被认为是最有希望实现DHA产业化的微生物。 目前国内外有关如何提高DHA含量的研究主要集中在以下几方面：（1)寻找高产 DHA的新菌株；（2)改进发酵工艺；（3)优化培养基；（4)添加外源因子。如培育的海洋真菌 裂殖壶菌0UC88生产的DHA占总脂肪酸的含量提高到23%?44% ;在另一干法制取DHA微 藻油的方法的研究中，该方法可在1L发酵液中提取最高达27. 6g DHA ;在第三种提高DHA 含量的研究中，通过优化裂殖弧菌菌株发酵培养基，使裂殖弧菌产生的DHA占总脂肪酸含 量达到35% ;在第四种提高DHA含量的研究中，通过外源添加因子促进微生物合成DHA的方 法，该方法通过在培养基中添加一种以上乙酸、柠檬酸和辛伐他汀，使DHA占总脂肪酸含量 最商达到42. 65%。以上研究虽然都以提商菌株中脂肪酸的DHA含量为目的，但往往考虑因 素单一，并未综合探索如何大幅提高菌株中DHA含量，使得生产DHA的工艺复杂、成本增加， 生产效率低，不利于实现裂殖壶菌生产DHA的产业化。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种能快速生长且高效合成DHA的裂殖壶菌 TC5-2。 本专利技术实施例的另一目的是提供一种获得裂殖壶菌TC5-2的诱变方法。 本专利技术实施例的又一目的是提供一种裂殖壶菌TC5-2生产DHA的应用。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下： 一种裂殖壶菌菌株，其分类名称为裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum)TC5_2， 并已于2013年3月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M2013075。 以及，一种裂殖壶菌TC5-2的诱变方法，包括以下步骤： 将裂殖壶菌菌种扩大培养得到种子液，将所述种子液接种至裂殖壶菌无菌发酵培 养基中进行发酵培养，得对数生长期菌液； 将所述对数生长期菌液制成菌膜，并利用能量为10?30keV的N+离子束采用 脉冲式对所述菌膜进行诱变处理，其中，所述诱变处理过程中的N+离子束的注入剂量为 50X 1017 ?200X 1017ions/cm2 ; 将经诱变处理后的菌膜进行培养、筛选出DHA产量高的裂殖壶菌TC5-2。 以及，上述裂殖壶菌株TC5-2或按照上述裂殖壶菌TC5-2的诱变方法获得裂殖壶 菌TC5-2用于生产DHA的应用。 上述新型的裂殖壶菌TC5-2繁殖能力强，且遗传性能稳定，是高产DHA的理想菌 株。 上述裂殖壶菌TC5-2的诱变方法中，通过N+离子束注入方式获得最佳诱变菌株 TC5-2,该诱变方法简单易实施，诱变所得菌株突变率高，遗传性能稳定。 上述裂殖壶菌株TC5-2用于生产DHA，其应用工艺简单，条件易控，效率高，且能显 著提高总脂肪酸和DHA的含量，有利于实现裂殖壶菌生产DHA的产业化。 【附图说明】 图1是本专利技术实施例裂殖壶菌TC5-2的诱变方法工艺流程图； 图2是本专利技术实施例裂殖壶菌TC5-2的菌体形态图。 【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于 限定本专利技术。 本专利技术实施例提供一种裂殖壶菌菌株，其分类名称为裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum)TC5-2,并已于2013年3月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号 为CCTCC NO :M2013075。该裂殖壶菌TC5-2的繁殖能力强，且遗传性能稳定，是高产DHA的 理想菌株。 相应地，本专利技术实施例还提供一种裂殖壶菌TC5-2的诱变方法，其诱变方法工艺 流程如图1所示，该方法包括以下步骤： S01.裂殖壶菌出发菌株的培养：以诱变前的裂殖壶菌为出发菌株，将出发菌种扩 大培养得到种子液，将所述种子液接种至裂殖壶菌无菌发酵培养基中进行发酵培养，得对 数生长期菌液； S02.采用离子束诱变：在无菌条件下，将步骤S01中的对数生长期菌液制成菌膜， 并利用能量为10?30keV的N+离子束采用脉冲式对所述菌膜进行诱变处理，其中，诱变处 理过程中N+离子束的注入剂量为50X 1017?200X 1017ions/cm2 ; S03.将经诱变后的菌膜进行培养、筛选处理：将步骤S02中诱变后的菌膜进行培 养、筛选出DHA产量高的裂殖壶菌TC5-2。 上述步骤S01中，裂殖壶菌TC5-2的出发菌株可以选用已知的裂殖壶菌，优选来源 于广西北海海滩红树林分离筛选所得的裂殖壶菌菌株。 该步骤S01中，该裂殖壶菌无菌发酵培养基可以直接选用现有裂殖壶菌无菌发酵 培养基，优选为下述利用裂殖壶菌TC5-2生产DHA的方法中使用的无菌发酵培养基。通过 对现有的发酵培养基进行改进，本专利技术的裂殖壶菌无菌发酵培养基营养丰富，可促进细胞 的快速分裂和生长繁殖，显著提高菌种的生长率和繁殖率。 上述步骤S02中，采用氮离子束注入方式诱变菌种，致使裂殖壶菌发生变异，且随 注入剂量的稳定增加，致死率也呈缓慢增长的趋势，见表1所示。优选地，上述氮离子束注 入剂量可以是 50X 1017、100X 1017、150X 1017、200X 1017ions/cm2。 上述步骤S03中，将经步骤S02离子束诱变处理的诱变菌种进行编号筛选。具体 筛选方法是将编号的诱变菌种进行扩大培养，比较各种诱变菌株生产DHA的含量，选出DHA 产率最高的诱变菌种。经筛选，发现裂殖壶菌TC5-2的DHA产率最高，高达46. 3%，因此选定 裂殖壶菌TC5-2为最佳菌株，其菌体形态如图2所示。 该步骤S03中，诱变菌种的扩大培养可以将该诱变菌种直接接种至上述S01中的 现有裂殖壶菌无菌发酵培养基进行扩大培养，优选直接接种至下述利用裂殖壶菌TC5-2生 产DHA的方法中使用的无菌发酵培养基进行扩大培养。 由上所述，上述裂殖壶菌TC5-2的诱变方法中，通过N+离子束注入方式获得最佳 诱变菌株TC5-2,该诱变方法简单易实施，诱变所得菌株突变率高，遗传性能稳定。 相应地，本专利技术实施例还提供裂殖壶菌TC5-2的应用，具体是将裂殖壶菌TC5-2用 于生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种裂殖壶菌菌株，其分类名称为裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)TC5‑2，并已于2013年3月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013075。

【技术特征摘要】
1. 一种裂殖壶菌菌株，其分类名称为裂殖壶菌（Schizochytriumlimacinum)TC5-2， 并已于2013年3月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO: M2013075。2. 裂殖壶菌TC5-2的诱变方法，包括以下步骤： 将裂殖壶菌菌种扩大培养得到种子液，将所述种子液接种至裂殖壶菌无菌发酵培养基 中进行发酵培养，得对数生长期菌液； 将所述对数生长期菌液制成菌膜，并利用能量为10?30keV的N+离子束采用脉冲式对 所述菌膜进行诱变处理，其中，所述诱变处理过程中的N+离子束的注入剂量为50XIO17? 200X1017ions/cm2 ； 将经诱变处理后的菌膜进行培养、筛选出二十二碳六烯酸产量高的裂殖壶菌TC5-2。3. 如权利要求2所述的裂殖壶菌TC5-2的诱变方法，其特征在于：所述无菌发酵培养 基包括如下组分： 人造海水 500 ~ 650g/L 大豆蛋白胨 25~35g/L 酵母膏35~45g./L 葡萄糖 80 ~ 100g/L 玉米浆 10 ~ 20g/L 复合维生素溶液4 ~ 6g/L。4. 如权利要求3所述的裂殖壶菌TC5-2的诱变方法，其特征在于：所述人造海水配方 包括以下组分： NaCI 25 ~ 30g/LMgCl2 4 ~ 6g，L KCl 0.5 ~ 1.5g/LCaCl2I~ 2g/L NaHSO4 5 ?7g/LNa2CO3 7 ~ 9g/L Na2SO4 9 ~ 11g/LMgSO4 2 ~...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭星，梁世中，
申请(专利权)人：郭星，
类型：发明
国别省市：广东;44