本发明专利技术提供了一种新型杂合抗菌肽CE-PR及其制备方法和应用。本发明专利技术通过对猪源抗菌肽PR-39与cecropin P1的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽cecropin P1的N端19个氨基酸与抗菌肽PR-39的N端26个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker(GPG)，并对抗菌肽cecropin P1的N端中的1处氨基酸进行突变(K12N)，获得一种新型杂合抗菌肽CE-PR，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型杂合抗菌肽CE-PR基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。
【技术实现步骤摘要】
-种杂合抗菌化CE-PR及其应用
本专利技术属于多肤筛选
，具体设及一种杂合抗菌肤及其应用。
技术介绍
[000引抗菌肤（antibacterial P巧tides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的多肤， 是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止，已在许多生物包括动物、植物及原核生物中发 现600多种内源性抗菌活性肤。猪源抗菌肤PR-39佑enBank登录号；NM_214450. 1)由39个 氨基酸组成，是Agerbedh B等于1991年首先从猪肠道分离得到的。其富含精氨酸（Arg) 和脯氨酸（Pro)两种氨基酸残基，形成一种Pro-Arg-Pro结构，可能与细菌磯脂膜相互作用 有关。其N端26个氨基酸的合成肤相对抗菌肤PR-39本身来说对多种革兰氏阴性菌、阳性 菌的抑制作用更强。抗菌肤cecropin P1是从猪小肠分离出得到的，其含有31个氨基酸残 基，分子量是333抓a,不含半脱氨酸，不能形成分子内二硫键，有强碱性的N端和强疏水性 的C端，其中酷胺化的C端对其广谱抗菌作用极为重要。cecropin P1氨基酸序列与昆虫 cecropin A有64%相似性，与cecropin B有75%的相似性。对其二级结构的理论预测及 CD谱和二维核磁共振数据表明，其分子内含有两亲水性a -螺旋和疏水性a -螺旋，中间是 形成柔性弯曲的谷氨酸-甘氨酸佑lu-Gly)卷曲序列。研究表明，其螺旋-卷曲-螺旋结 构对保持高抗菌活性具有特殊的重要性。 天然的抗菌肤在临床应用存在各种缺点，有的在对病原微生物高杀灭活性的同时 往往伴随着溶血作用，有的本身就对真核细胞有毒性（例如天然抗菌肤蛙皮素、防御素和 蜂毒素等）。随着对抗菌肤结构功能与杀菌机理研究的深入，人们开始尝试设计杀菌活力更 强、抗菌谱更广的新型杂合抗菌肤。杂合抗菌肤设计通常采用的方法是将不同来源抗菌肤 保守序列拼接，而后通过氨基酸替换等生物学修饰，W期抗菌活性高且溶血性低的新型抗 菌肤。目前，国内外已设计合成了许多种杂合肤，抑菌效果明显优于天然肤，且大大降低了 毒性和溶血性。总之，杂合肤的成功设计和应用对解决当前抗菌肤存在的问题有着重要意 义和实用价值
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种杂合抗菌肤CE-PR，从而弥补现有技术的不足。 本专利技术首先提供一种杂合抗菌肤CE-PR，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ； 本专利技术的杂合抗菌肤CE斗R可用做畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制 剂。 本专利技术还提供一种杂合抗菌肤CE-PR的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如 下： [000引 1)根据杂合抗菌肤CE斗R的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肤 基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒； 2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达杂合抗菌肤CE斗R的重 组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出杂合抗菌肤CE-PR ; 3)对重组表达的杂合抗菌肤CE斗R进一步浓缩、纯化后，测定效价。稀释分装，即 为抗菌肤制剂。 本专利技术在对猪源抗菌肤PR-39与cecropin P1的氨基酸序列进行空间结构分析的 基础上，将抗菌肤cecropin P1的N端19个氨基酸与抗菌肤PR-39的N端26个氨基酸进 行拼接，中间加入蛋白Lingker(GPG)，并对抗菌肤cecropin P1的N端中的1处氨基酸进行 突变化12脚，获得一种新型杂合抗菌肤CE-PR，使其抗菌效力获得显著提高。 【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本专利技术，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本专利技术的技术方案的情况下可W对本专利技术的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，该些修改和替换均落入本专利技术保护范围内。 实施例1杂合抗菌肤CE-PR及其基因的获得 1、利用生物软件对猪源抗菌肤cecropin P1 (GenBank登录号；AB186032)和抗菌 肤PR-39佑enBank登录号；NM_214450. 1)的氨基酸序列进行空间结构分析，选取抗菌肤 cecropin P1的N端具有a -螺旋结构的19个氨基酸为基础，并将其第12位疏水性氨基酸 替换成亲水性氨基酸赖氨酸化12脚，然后将其与抗菌肤PR-39抑菌活性较强的N端26个氨 基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker KPG)，获得一种新型杂合抗菌肤CE-PR，其氨基酸序 列为 SEQ ID N0:1。 2、根据获得的新型杂合抗菌肤CE-PR的氨基酸序列SEQ ID NO: 1，按照毕赤酵母 基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型杂合抗菌肤CE-PR的核巧酸序列。并在其 N端引入Kex2酶切位点。两端引入化〇1和甜al酶切位点，W便于克隆入毕赤酵母表达载 体中。 实施例2基因工程杂合抗菌肤CE斗R表达载体的构建与工程菌的获得 1、将含抗菌肤基因的载体和酵母表达载体均用化〇1和甜al双酶切，酶切产物回 收并连接，进行PCR鉴定、测序。 2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后 均匀涂布于含100 y g/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30°C解育3-5天。待YPDS平板上的 阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 y g/mL、500 y g/mL、1000 y g/ mL的YPDS选择平板，W在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。 3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 y g/mL Zeocin的YTO培养液中， 28 °C振摇培养18个小时。取此菌液按4 %体积比转接于5ml BMGY培养基中，28 °C摇振培养 18-2化左右，0D600值约为5-6。培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28°C继续摇振培 养。为了维持诱导表达，每隔2化补加100%甲醇使终浓度达1%。4她后，4°C 50(K)r/min 离屯、lOmin，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新 型杂合抗菌肤CE-PR的阳性菌株。 实施例3发酵、纯化新型杂合抗菌肤CE-PR的制备 1、发酵工艺 1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1% -10%接种量接种于S角瓶，28-30°C， 20化/111111摇床培养16-2化后^5%-20%接种量接入1化发酵罐（实装培养基化)，温度 28-30°C，转速 500-1500r/min，培养基抑值 5. 0-6. 0,通气量 0. 1-1. 0VVM(1L 发酵液 Imin 通入的氧气量），溶氧>20 %情况下进行发酵，在培养18-2化后流加50 %甘油化，待溶氧突 然升至100 %时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-7化。 [002引 2)发酵结束后原罐蒸汽100°C灭菌10-20min，放料，5000r/min离屯、lOmin，收集发 酵上清即为抗菌肤半成品。 如新型抗菌肤制剂 抗菌肤半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和W生化方法精制、纯 化后得到液体制剂。 上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种杂合抗菌肽CE‑PR，其特征在于，所述的杂合抗菌肽CE‑PR的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
1. 一种杂合抗菌肽CE-PR，其特征在于，所述的杂合抗菌肽CE-PR的氨基酸序列为SEQ ID NO:1〇2. 权利要求1所述的杂合抗菌肽CE-PR的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下 步骤： 1) 根据新型杂合抗菌肽CE-PR的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽 基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入Xhol和Xbal酶切位点，以便于克隆入 毕赤酵母表达载体中； 2) 将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用Xhol和Xbal双酶切，酶切产物回收并连接， 进行PCR鉴定、测序； 3) 阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀 涂布于含100 y g/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30°C孵育3-5天；待YPDS平板上的阳性 转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin200 y g/mL、500 y g/mL、1000 y g/mL的 YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株； 4) 将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 y g/mL Zeocin的YH)培养液中，28°C振 摇培养18个小时；取此菌液按4...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宏华，
申请(专利权)人：青岛宏昊生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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