OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖中的应用制造技术

一种OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖中的应用，通过从miR156家族中筛选出对水稻分蘖发育具有重要调控作用的OsmiR156f基因，并对其前前体pri-miR156f序列进行克隆，通过采用茎杆特异启动子载体构建方法，将能够增加分蘖的OsmiR156f基因导入水稻中，在水稻的茎杆中特异表达，以调控水稻分蘖的发育。使得转基因水稻能够适当增加水稻早期的分蘖能力，而高节位上的蘖芽及后期分蘖仍旧受到抑制，从而可以提高单株水稻的有效分蘖数量，而不增加无效分蘖数，使转基因株系的稻穗数量适当增加而稻穗长度、千粒重等产量相关性状受到的影响小，最终达到实现单株增产的目的。

【技术实现步骤摘要】
OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖并提高水稻单株产量中的应用
本专利技术涉及农业生物
，尤其涉及一种OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖中的应用，具体地说是涉及利用特异启动子将分蘖相关OsmiR156f基因在茎杆中特异表达的载体构建方法。
技术介绍
分蘖是水稻品种选育的重要指标之一，分蘖能力直接影响稻穗的数目进而影响水稻产量。水稻只有主茎和早期发生的初生和次生分蘖才具备成穗能力，属于有效分蘖；而后期的次生分蘖因生育期短等因素造成不能成穗，属于无效分蘖。在生产中，只有有效分蘖对水稻产量具有贡献，而无效分蘖不仅不能形成稻穗，而且还会影响稻穗的长度而导致水稻产量减低，且过多的无效分蘖除造成生物学上的物质浪费，还会导致田间环境恶化、易滋生病虫害等问题。目前普遍认为高产水稻应具有较强的有效分蘖能力，在水稻生产过程中增加早期有效分蘖、控制后期高节位无效分蘖有利于提高产量。水稻分蘖的形成过程可分为两个主要步骤，即分蘖芽的形成和分蘖芽的伸长。目前，已经克隆了许多与水稻分蘖相关的功能基因，如已知MOC1参与了叶腋分生组织、分蘖芽的形成和分蘖伸长过程，OsTB1则作为负调节因子控制着分蘖芽的伸长，HTD1控制分蘖芽形成，LAZY1、TAC1、PROG1控制分蘖角度，OSH1、DWARF10[控制蘖芽萌发，D53负调控独脚金内酯信号转导进而影响分蘖，OsPIN1、D3、D27等基因均直接影响水稻的分蘖。除上述功能基因外，microRNA也可调控水稻分蘖的发育，如在水稻中过表达OsMIR156d和OsMIR156h导致株高变矮分蘖增多，而增加OsmiR156的靶基因OsSPL14的表达具有减少分蘖、增加小穗数或穗长的功能。由于通过传统育种手段选育的具有多分蘖特性的水稻品种(材料)增产效果不理想。迄今为止，生产上主要通过提高单位面积内秧苗播种密度来提高水稻的有效穗数，但常常由于难以把握适当的播种数量而导致增产效果不佳。随着分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，利用水稻分蘖相关基因来调控分蘖发育为水稻生产开辟了一个全新的途径，并取得了一些重要进展。但现有的通过转基因技术获得的多分蘖转基因水稻材料存在无效分蘖数比例过高造成穗形变小而导致减产的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是，针对现有技术中在水稻过表达miR156家族成员可显著增加水稻的分蘖能力但无效分蘖数目太多、比例过高的问题，提供一种OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖并提高水稻单株产量中的应用。为达上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖并提高水稻单株产量中的应用，是通过利用茎杆特异启动子D18启动子驱动该OsmiR156f基因构建茎杆特异表达载体pWM-D18p-OsMIR156f，并使该基因在水稻的茎杆中过表达而实现的，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术的另一目的是提供一种重组表达载体在增加水稻有效分蘖并提高水稻单株产量中的应用，该重组表达载体是利用茎杆特异启动子D18启动子驱动该OsmiR156f基因构建的茎杆特异表达载体pWM-D18p-OsMIR156f，该OsmiR156f基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术的再一目的是提供一种培育转基因水稻的方法，是将含水稻分蘖相关OsmiR156f基因的重组表达载体导入水稻愈伤组织进行培育，获得有效分蘖数目增加且单株产量提高的转基因水稻，该重组表达载体是利用茎杆特异启动子D18启动子驱动该OsmiR156f基因构建的茎杆特异表达载体pWM-D18p-OsMIR156f，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术从miR156家族中筛选出对水稻分蘖发育具有重要调控作用的OsmiR156f基因，并对其前前体pri-miR156f序列(如SEQIDNo.1所示，序列长度为382bp)进行克隆，并通过采用茎杆特异启动子载体构建方法，将能够增加分蘖的OsmiR156f基因导入水稻中，在水稻的茎杆中特异表达，以调控水稻分蘖的发育。使得转基因水稻能够适当增加水稻早期的分蘖能力，而高节位上的蘖芽和后期分蘖仍旧受到抑制，从而可以提高单株水稻的有效分蘖数量，降低无效分蘖比例，使转基因株系的稻穗数量适当增加而稻穗长度、千粒重等产量相关性状受到的影响小，最终达到实现单株增产的目的。附图说明图1是不同启动子驱动OsMIR156f转化水稻后对分蘖的影响。图中：1-野生型水稻；2-组成型过表达OsMIR156f转基因水稻，水稻分蘖数显著增多、株高变矮；3-茎杆特异表达OsMIR156f转基因水稻，水稻分蘖数目适当增多。图2是不同启动子驱动OsMIR156f转化水稻后对稻穗长度的影响。图中：1-野生型水稻；2-组成型过表达OsMIR156f转基因水稻，水稻稻穗长度显著缩短；3-茎杆特异表达OsMIR156f转基因水稻，对稻穗长度影响不大。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所实验的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业公司购买。实施例1OsMIR156f基因片段的扩增根据网上已公布的日本晴基因组序列，采用Primer3.0软件设计引物(由生物公司合成)，引物序列为：正向引物5’-CGCCCACCTTTCTTCTCCCA-3’(见SEQIDNo.2)，反向引物5’-AAGGAGCAGTTAGATAATGGAG-3’(见SEQIDNo.3)。将合成引物用双蒸水配置成浓度为10μmol·L-1的溶液。采用CTAB法从水稻日本晴叶片中提取基因组DNA。以提取的DNA为模板，利用高保真的pfuTaq酶进行PCR扩增，获得OsmiR156家族中的OsMIR156f对应的前前体pri-miR156f序列,其中PCR扩增的反应体系为50μL：DNA模板1.0μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，10μmol·L-1的dNTP0.5μL，10X缓冲液5.0μL，pfuTaq酶0.3μL，双蒸水42.2μL。扩增条件为：94℃3min；94℃30s,58℃30s,72℃1min,32个循环；72℃延伸5min。将PCR扩增产物经1％的凝胶电泳后，切下含目标片段的凝胶利用试剂盒回收产物，将回收产物利用T4ligase酶连接到由EcoRV酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156f，将连接产物用热激发转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，并均匀涂布在含50μmol·L-1氨苄抗生素的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选。挑选白色单菌落放入10mL液体LB培养基中，置于37℃、200rpm条件下培养10h。利用试剂盒从2-5mL的扩繁菌液中提取质粒，并送生物公司进行测序分析，将测序结果用NCBI数据库进行比对分析，如果有碱基错误则必须重新挑选单菌落提取质粒后再送测序分析，只有所得测序结果中的目标序列pri-miR156f的碱基与数据库中的序列碱基完全一致才可进行后续步骤操作。实施例2构建组成型过表达载体pWM-UBQpro-OsMIR156f(UbiPro-OsMIR156f)组成型启动子选优采用Ubiquitin1启动子。分别采用HindⅢ/salI酶切载体pWM101、HindⅢ/Ba本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加水稻有效分蘖的OsmiR156f基因在调控水稻分蘖发育中的应用，其中，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种OsmiR156f基因在增加水稻早期有效分蘖并提高水稻单株产量中的应用，是通过利用茎杆特异启动子D18启动子驱动该OsmiR156f基因构建茎杆特异表达载体pWM-D18p-OsMIR156f，并使该基因在水稻的茎杆中过表达而实现的，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种重组表达载体在增加水稻早期有效分蘖并提高水稻单株产量中的应用，该重组表达载体是利用茎杆特异启动子D18启动子驱动该OsmiR156f基因构建的茎杆特异表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖浪涛，刘清，王若仲，彭克勤，李合松，童建华，苏益，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43