本申请针对癌症中的突变高发基因，提供了用于癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒，其包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对，例如SEQ ID NO:1-22所示的11对引物。该试剂盒可用于癌症诊断或辅助诊断、癌症预后监测或指导癌症治疗用药等目的。本申请还提供了相应的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
癌症检测方法、试剂盒及其应用 专利
本申请大体上涉及癌症中的突变高发基因的检测。具体而言，本申请提供了基于 多重PCR和高通量测序技术的用于癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒和检测方 法。所提供的检测结果例如可用于癌症诊断或辅助诊断、癌症预后监测或指导癌症治疗用 药等目的。 专利技术背景 癌症是全球最主要的非传染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病。我国 每年因癌症死亡的人数高达270万，其中以肺癌、结直肠癌、胃癌等消化道恶性肿瘤最为严 重。女性中以乳腺癌为首的妇科恶性肿瘤也是癌症死亡的主要原因。据统计，我国肺癌的 发病率为53. 57/10万，死亡率高达45. 57/10万，两个比例均处于所有恶性肿瘤之首。胃癌 次之，发病率为36. 21/10万。乳腺癌的发病率处于女性肿瘤之首，为42. 55/10万。 抗肿瘤靶向药物是目前治疗癌症较为有效的一种手段，2013年全球销量前十大药 物近一半为抗肿瘤靶向药物。抗肿瘤靶向药物和其他化疗药物疗效和毒副作用因人而异， 这是因为从本质上讲，癌症是一种多基因突变造成的疾病。关键基因的突变、截短、错位或 融合等导致肿瘤发生。由于不受控的增殖，肿瘤细胞会发生更多的基因突变，导致肿瘤恶 性化程度加深、转移和抵抗治疗。识别个体肿瘤特异性的驱动基因突变因此成为有效的选 择靶向药物应用的关键。目前NCCN(美国国立综合癌症网络）已对多种靶向药物的使用作 出规定，建议其在用于肿瘤治疗前进行基因突变检测以确定是否适合用药，例如吉非替尼 (gefitinib)、曲妥珠单抗（Trastuzumab)等。 随着科技发展，抗肿瘤药物的发展也表现出药物使用从单一到联合的趋势。以前 靶向药物以单药加化疗为主，但大多数肿瘤是多基因疾病，针对单个靶点治疗虽然能延长 生存，但很少能根治，故目前多个靶向药物的联合治疗研宄越来越多，其中最成功的例子就 是BRAF和MEK抑制剂联合治疗黑色素瘤。能同时、快捷地检测多个药物靶点基因的方法就 变得尤为重要，结合高通量测序的个体化基因治疗也被认为是肿瘤治疗最终努力的方向。 目前常见的检测基因突变的方法有荧光定量PCR法和Sanger测序法（一代测 序）。荧光PCR法具有灵敏度高的特点，且技术已经成熟，应用广泛，但是每对引物只能检测 一种突变，且每种突变需要单独建立一个PCR反应体系，导致样品用量较大，且无法同时检 测太多样品或位点。在Sanger测序法中，单对引物可检测多个突变，具有成本低等特点，但 同样所需样品量大，且对低频突变的检测不够令人满意。 因此，本领域目前仍需要能够实现癌症驱动基因的检测工具。 专利技术概述 第一方面，本申请提供了用于癌症样品或疑似癌症样品的多基因、多位点突变检 测的试剂盒，其包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部 的一个或多个外显子的区域的引物对。 在一些实施方案中，试剂盒包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中 每一个的一个或多个外显子的区域的引物对。 本申请的试剂盒可用于癌症诊断或辅助诊断、癌症预后监测或指导癌症治疗用药 等目的。 在一些实施方案中，癌症选自肺癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤。 在一些实施方案中，癌症是肺癌。 在一些实施方案中，BRAF基因的外显子选自外显子11和/或15。 在一些实施方案中，EGFR基因的外显子选自外显子18、19、20、21或其任意组合。 在一些实施方案中，KRAS基因的外显子选自外显子2和/或3。 在一些实施方案中，PIK3CA基因的外显子选自外显子9和/或20。 在一些实施方案中，用于扩增BRAF基因的外显子11的区域的引物对如SEQ ID NO :1和2所示。 在一些实施方案中，用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对如SEQ ID NO :3和4所示。 在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对如SEQ ID NO :5和6所示。 在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对如SEQ ID NO :7和8所示。 在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO :9 和 10 和 / 或 SEQ ID NO :11 和 12 所示。 在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对如SEQ ID NO : 13和14所示。 在一些实施方案中，用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对如SEQ ID NO : 15和16所示。 在一些实施方案中，用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对如SEQ ID NO : 17和18所示。 在一些实施方案中，用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对如SEQ ID NO : 19和20所示。 在一些实施方案中，用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO :21和22所示。 在一些实施方案中，试剂盒包含如SEQ ID NO :1-22所示的11对引物。 在一些实施方案中，试剂盒包含用于从所述样品提取基因组DNA的试剂。 在一些实施方案中，试剂盒包含利用所述引物进行多重PCR反应的试剂。 在一些实施方案中，试剂盒包含用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量 测序技术中的试剂。 在一些实施方案中，试剂盒包含用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试 剂。 在一些实施方案中，高通量测序选自Ion Torrent测序、Ion PGM测序、HiSeq 2000测序以及MiSeq测序。 在一些实施方案中，高通量测序为Ion Torrent测序。 在一些实施方案中，试剂盒包含非癌对照样品、和/或BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA 基因中的一个或多个未发生突变的癌症对照样品。 第二方面，本申请提供了本申请提供了用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因 中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对在制备用于癌症诊断或辅助 诊断、或用于癌症预后监测、或用于指导癌症治疗用药的试剂或试剂盒中的用途。 第三方面，本申请提供了体外检测癌症样品或疑似癌症样品中BRAF、EGFR、KRAS 和PIK3CA基因突变的方法，包括以下步骤： (1)获得个体的癌症样品或疑似癌症样品的基因组DNA ; (2)利用分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部 的一个或多个外显子的区域的引物对对获得的基因组DNA进行多重PCR ; (3)对扩增产物进行高通量测序，优选Ion Torrent测序；以及 (4)分析测序结果，确定BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中是否发生突变。 附图简要说明 图1显不了癌症驱动基因突变所在的主要彳目号通路。 图2为本申请的检测方法的一个实施方案的示意性流程图。 图3显示了样品L1083的按照本申请的检测方案和按照Sanger测序法的检测方 案的验证结果。 图4显示了样品L738的按照本申请的检测方案和按照Sanger测序法的检测方案 的验证结果。 图5显示了样品L735的按照本申请的检测方案和按照Sanger测序法的检测方案 的验证结果。 图6显示了样品152的本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于癌症样品或疑似癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒，其包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对。
【技术特征摘要】
1. 用于癌症样品或疑似癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒，其包含分别用 于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区 域的引物对。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述癌症选自肺癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素 瘤，优选地，所述癌症为肺癌。3. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其中BRAF基因的外显子选自外显子11和/或15 ; EGFR基因的外显子选自外显子18、19、20、21或其任意组合；KRAS基因的外显子选自外显子 2和/或3 ;PIK3CA基因的外显子选自外显子9和/或20。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其中 用于扩增BRAF基因的外显子11的区域的引物对如SEQ ID NO:l和2所示； 用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对如SEQ ID NO:3和4所示； 用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对如SEQ ID NO:5和6所示； 用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对如SEQ ID NO:7和8所示； 用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO: 9和10和/或SEQ ID NO: 11和12所示； 用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对如SEQ ID NO: 13和14所示； 用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对如SEQ ID NO: 15和16所示； 用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对如SEQ ID NO: 17和18所示； 用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对如SEQ ID NO: 19和20所示；或 用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO: 21和22所示。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其包含如SEQ ID NO: 1-22所示的11对引物。6. 如权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，还包含以下一种或多种试剂： 用于从所述样品提取基因组DNA的试剂； 利用所述引物进行多重PCR反应的试剂； 用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐川宁，
申请(专利权)人：北京圣谷同创科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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