用带负电荷颗粒对多核苷酸的色谱纯化制造技术

纯化包括多核苷酸的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供填充的色谱柱，其具有带负电荷的多孔颗粒，(ii)将所述柱平衡至所述样品中的多核苷酸洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得施加于所述填充的色谱柱的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱多核苷酸，其中所述多核苷酸处于更纯的状态且处于所述填充的色谱柱平衡至的条件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用带负电荷颗粒对多核苷酸的色谱纯化相关申请的声明本申请要求2013年3月6日提交的美国临时申请号61/773,666和2012年5月31日提交的美国临时申请号61/653,694的优先权，其内容通过引用整体并入本文。专利
本专利技术涉及用于纯化多核苷酸的方法。其进一步涉及这些能力与其它纯化方法的结合以达到期望的最终纯化水平。专利技术背景具有带电荷表面的固体材料被广泛地用在多核苷酸纯化领域中。这些材料通常包括离子交换剂，所述离子交换剂经常以2种应用形式中的任一种采用。在结合-洗脱模式中，将多核苷酸和离子交换剂平衡至允许目标多核苷酸物质结合的条件。与带电荷表面较弱地相互作用或根本不相互作用的污染物不会结合并被消除。比多核苷酸更强地相互作用的污染物会更强地结合。洗涤以除去未结合的污染物以后，可以通过增加盐浓度来洗脱柱。这允许其与离子交换剂的相互作用强度处于递增次序的结合物质的分级分离，由此实现高多核苷酸纯化程度。在流穿模式中，例如在阳离子交换剂上，将样品和离子交换剂平衡至阻止多核苷酸结合的条件。与多核苷酸相比更强烈地与离子交换剂相互作用的物质发生结合且由此被除去，但是比多核苷酸更弱地结合的物质与它一起流穿且作为污染物持续。两种模式在存在于多种固相体系结构(包括填充在柱中的多孔或无孔颗粒)中的带电荷表面上进行，或直接加入大体积水性样品中，或在整体料或膜上。这些不同的体系结构会赋予不同的流动性能、能力和分辨率，但是限定流穿或结合-洗脱色谱法的化学特征是恒定的(不论物理形式如何)。两种方法依赖于离子交换剂和样品平衡至向柱引入样品之前的相同条件。一些色谱介质体现了电荷与其它类型的化学官能团的组合。这些介质被概括地称作混合模式或多模式材料，且可以将电荷与疏水基团、金属亲和力、有利于氢键形成的基团或化学基团进行不同地组合。取决于第二官能团的性质，它们在不同的化学条件下运行，但是它们仍然以结合-洗脱和流穿模式运行。已经描述了少数将电荷与物理官能团组合的多模式材料，例如，在带电荷材料也具有根据物质的大小来分选所述物质的能力的情况下。一个这样的例子采用与正电性表面组合的可变尺寸排阻官能团[Hunter,A.,J.Chromatogr.A897:65-80(2000)；Hunter,A.,J.Chromatogr.A897:81-97(2000)；Hunter,A.,J.Chromatogr.A930:79-93(2000)；Hunter,A.,J.Chromatogr.A971:105-116(2000)]。所述方法通常包括，使蛋白以尺寸依赖性的方式进入颗粒孔中，同时表现出对蛋白上的电荷以及缓冲液条件的协同依赖性。象用于分级分离的其它带电荷材料一样，所述方法采用结合-洗脱和流穿操作模式。最近(Nian等人.J.Chromatogr.A1282(2013)127-132.)，已经描述了被称作空隙排阻色谱法的新色谱法模式。用于实施所述方法的材料包括用正电性颗粒填充的柱(参见Hunter出处同上)，前提条件是，施加于柱的样品体积不大于被颗粒之间的空间占据的体积。描述了用于纯化抗体的方法。
技术实现思路
提供了用于纯化多核苷酸的方法、材料和试剂盒。在某些实施方案中，本专利技术提供了用于纯化包含多核苷酸的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供填充的色谱柱，其包含带负电荷的多孔颗粒，(ii)将所述填充的色谱柱平衡至允许所述样品中的多核苷酸洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得施加于所述填充的色谱柱的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间，和(iv)从所述填充的色谱柱洗脱多核苷酸，其中所述多核苷酸处于更纯的状态。专利技术的详细描述在某些实施方案中，本专利技术涉及用负电性的多孔颗粒填充的柱，其中多核苷酸可以通过静电排斥力(其不依赖于来自孔的空间位阻或与来自孔的空间位阻组合)或仅通过来自孔的空间位阻而基本上限于颗粒之间的空间(即颗粒间或空隙空间)。这可以造成所述多核苷酸基本上(如果不是排它地)穿过空隙空间而经过柱。具体地，空间位阻表示这样的机制：其中在阻止多核苷酸克服由孔内的带负电荷的配体的构型产生的物理阻力的条件下，多核苷酸不能进入孔空间中。许多污染性蛋白(包括从生产多核苷酸的宿主细胞产生的那些)和细胞培养基组分(包括盐、非离子的物质、和两性离子的物质)能够进入颗粒的孔中，这被认为(不限于任何具体理论)会减慢它们穿过柱的运输，并造成它们随着缓冲液流过柱而变得与更快迁移的多核苷酸分离。酸性污染物可以通过结合至负电性表面而进一步减慢。已经发现，该方法允许有效地分级分离尤其是多核苷酸，不论样品条件如何，不论大多数污染物的化学特性如何，且不论在样品施加以后为了迫使多核苷酸穿过柱而立即施加的缓冲液的组成如何。在某些实施方案中，本专利技术的一个优点是，它可以在宽范围的条件(pH、盐浓度、电导率等)下实施，且因此可以为了在制备和纯化多核苷酸的过程中方便实现本专利技术的方法以及在本专利技术的方法之前或之后的方法而选择那些条件。在某些实施方案中，通过将样品施加限制为不超过柱内的带负电荷颗粒的颗粒间体积的体积，可以实现这些独特的操作特征和结果。另外，在某些实施方案中，所述方法既不与其它类型的带负电荷材料(包括无孔的颗粒、膜或整体料)一起应用，也不通过将带负电荷的多孔或无孔颗粒或可溶性的带负电荷聚合物分散在样品内来应用。相反，在本专利技术的某些实施方案中，所述方法用多孔颗粒的填充柱实现。在某些实施方案中，与使用多孔颗粒填充柱的其它多核苷酸纯化方法相比，本专利技术是非常有利的，因为穿过颗粒间空间的运输是对流的，而不是扩散的。这允许所述方法以比其它颗粒-柱方法更高的流速有效地进行，这会转化成更高的生产力。已经进一步发现，可以如下增强本专利技术的某些实施方案的固有分级分离能力：在柱床内的颗粒上包括额外表面官能团，只要将柱平衡至不会造成多核苷酸被那些额外官能团截留或显著减慢的条件。这样的官能团可以包括、但不限于带正电荷的基团、疏水基团、π-π键合基团、氢键合基团或金属-螯合基团。这些额外官能团可以位于与带负电荷的基团相同的化学部分上，位于与带负电荷的基团相同的多孔颗粒上，或位于可为多孔或无孔的不同颗粒上。在通过包括额外颗粒而添加第二官能团的情况下，可以施加的样品的体积可以限于这样的体积：其对应于仅在柱中的带负电荷的多孔颗粒之间存在的颗粒间空间。该体积可以估计为柱中的带负电荷的多孔颗粒的重力沉降体积的约40％，但是如果物理地压缩颗粒床的话可以更小，且可以通过实验定量地确定。在某些实施方案中，可以如下增强通过所述方法提供的纯化程度：用试剂预处理所述样品，以促进可能已经与多核苷酸结合的污染物的解离。这样的试剂具体地包括各种解离剂，包括高浓度的盐、脲、氨基酸、非离子有机聚合物、有机溶剂和表面活性剂等。在某些实施方案中，在高达6M浓度的离液盐胍对于从新鲜匀浆化的细胞或其它复杂制品解离多核苷酸而言可能是特别有用的。在所述方法的常规实施过程中，与样品中的其它小分子一起除去解离剂。这凸显了本专利技术的2个优点：第一个是，它不需要将样品预先平衡至所述柱将运行的条件，即使当样品条件根本不适合用于以结合-洗脱或流穿模式进行离子交换色谱法时；第二个是，不论样品的组成如何，样本文档来自技高网...

【技术保护点】
纯化包含多核苷酸的样品的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供填充的色谱柱，其包含带负电荷的多孔颗粒，(ii)将所述填充的色谱柱平衡至允许所述多核苷酸洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得施加的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱多核苷酸，其中所述多核苷酸处于更纯的状态。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.31 US 61/653,694;2013.03.06 US 61/773,6661.纯化包含多核苷酸的样品的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供填充的色谱柱，其包含带负电荷的多孔颗粒，(ii)将所述填充的色谱柱平衡至允许所述多核苷酸洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得施加的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱多核苷酸，其中所述多核苷酸处于更纯的状态。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸是基因组DNA、细胞器DNA、质粒DNA、单链DNA、或双链DNA。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸是线粒体DNA或叶绿体DNA。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是未纯化的，处于中间纯度水平，或高度纯化的。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸在施加于所述柱之前已经经过浓缩。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸在施加于所述填充的色谱柱之前已经通过超滤进行浓缩。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品在施加于所述填充的色谱柱之前已经预先在使多核苷酸基本上不结合一个或多个带负电荷的表面的条件下暴露于所述表面。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个带负电荷的表面进一步包含第二反应性，所述第二反应性包括参与疏水相互作用、金属亲和相互作用或它们的组合的能力。9.根据权利要求7或8中的任一项所述的方法，其中所述一个或多个带负电荷的表面包括膜、整体柱、一个纤维或多个纤维、一个颗粒或多个颗粒或其组合。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱仅用带负电荷的多孔颗粒填充，且样品体积小于所述填充的色谱柱的体积的40％。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡至在2至9范围内的pH。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡至在0.1mS/cm至30mS/cm范围内的电导率值。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱用具有在选自以下范围内的pH的缓冲液平衡：(1)2至8，(2)4至7，和(3)4.5至6.0。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡至在0.1mS/cm至15mS/cm范围内的电导率值。15.根据权利要求1所述的方法，其中为了在包含多核苷酸的洗脱液上进行后续纯化步骤中使用，所述填充的色谱柱被平衡至...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·加尼翁，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG