一种负载t-PA基因的生物支架及其制备方法技术

本发明专利技术涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种负载t-PA基因的生物支架及其制备方法。本发明专利技术负载t-PA基因的生物支架包括支架、覆盖在支架表面的基底层，覆盖在基底层表面的基因层，以及在支架外表面的封涂层。其不锈钢支架表面层模拟血管基底膜物质，可诱导血管内皮快速匍匐支架表面，防治血栓形成；纳米基因层起到缓释和控释基因药物作用；两层纳米粒之间的透明质酸层起到连接层作用，因其带负电荷，纳米粒在酸性环境表面呈正电，通过电荷吸引作用将两层纳米粒牢固结合在一起。最外层为支架纳米基因转染提供良好的微环境。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医疗器械
，具体涉及一种负载t-PA基因的生物支架及其制备方法。
技术介绍
目前临床使用的支架主要有裸金属支架(bare metal stents，BMSs)和药物洗脱支架(drug eluting stents，DESs)两种。药物洗脱支架主要构成包括：裸金属骨架、大分子多聚物以及抗增生药物如everolimus，biolimus或sirolimus等。多项随机调查显示，与单独球囊成形术相比，BMSs可明显减少介入治疗的并发症以及后期再狭窄发生；与BMSs相比，DESs明显减少再狭窄，但支架内血栓形成令人担忧。第一代DESs含有sirolimus or paclitaxel，可明显减少支架内血管内膜增生，使临床再狭窄发生率明显减少。然而，由于血管对聚合物过敏和慢性炎症刺激导致动脉局部愈合延迟特别是内皮化过程受阻，加速了新的粥样硬化斑块形成并增加了支架内血栓形成的机会，尤其是后期(1个月至1年)和更后期(1年以上)血栓形成，使临床抗血栓治疗的期限明显延长。第二代和第三代DESs主要针对上述不足，设计采用了更细的支撑骨架、更耐久和生物相容性更好甚至生物可吸收的聚合物以减轻炎症并减少过敏反应，并且采用了新的抗增生药物，使支架内血栓形成率显著降低，其效果有待临床验证。预防支架内血栓形成尤其是后期血栓形成，临床主要采取术后抗凝治疗。常用的抗凝药物包括warfarin，heparin，aspirin等，但长期抗凝治疗可能导致出血等并发症；一旦停药可能出现血栓再生。组织型纤溶酶原激活物(T-PA)是另一类溶血栓药物，它是由527个氨基酸构成的丝氨酸蛋白酶，主要功能是溶解纤维蛋白，不发生凝血和没有纤维蛋白产生，T-PA几乎内有活性。肝脏是其主要代谢场所，循环中的半衰期只有5-10分钟。临床上已使用重组t-PA有效地治疗急性心肌梗死和缺血性中风，但肺出血和颅内出血是主要问题，甚至危及生命。自t-PA的cDNA的成功克隆，人们已成功构建其逆转录病毒载体并在体外转染内皮细胞和高表达t-PA蛋白，将这种内皮细胞贴附于冠脉支架或冠状动脉搭桥吻合口表面获得了预防血栓或再狭窄的效果。基因治疗提供了局部高表达t-PA的方法并避免了全身出血和血栓反弹。我们曾经构建了高表达t-PA基因质粒，用外科缝线携带转染猪心肌并成功预防了心脏二尖瓣膜置换术后血栓形成和冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄。尽管这种载体是安全、方便和有效的，但外科缝线是异物且方法具创伤性，不适于药用。应用高分子聚合物制备纳米粒作为转基因载体已成为一种较新的方法。白蛋白以其生物相容、可降解、无免疫源性和没有毒性，是一种较理想的制备纳米载体原料。白蛋白纳米粒直接通过表面静电吸附基因DNA携载基因。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种抑制内膜增生、血栓形成和预防再狭窄的负载t-PA基因的生物支架。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：提供一种负载t-PA基因的生物支架的制备方法，包括如下步骤：步骤1：白蛋白纳米溶液的制备：以白蛋白和t-PA基因质粒为原料制备t-PA基因质粒的白蛋白纳米溶液；涂层支架的制备：a、按每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制支架表面涂层液；b、将支架经无菌处理后，置于经超声波震荡处理的支架表面涂层液中，于25℃条件下孵育1h后无菌风干，在直径3mm的球囊上压模成型，得涂层支架；步骤2：将步骤1所得涂层支架浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；步骤3：将步骤2所得涂层支架浸于透明质酸液中孵育30-40min，晾干，浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；步骤4：将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法中，所述支架为316L不锈钢支架网。优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法中，所述白蛋白纳米溶液的制备具体为：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1M HCI调整pH值至5.5，得溶液A，将1mg t-PA质粒加入溶液A中孵育30min后，在超声场中滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，搅拌，静置2h，减压使残余的乙醇挥发，所得溶液17000r/min离心30min，所得沉淀用双蒸水重悬并用超声波分散成乳胶状，所得为白蛋白纳米溶液。优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法中，所述步骤4具体为：重复步骤3的方法1-3次，将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。本专利技术的另一技术方案为提供一种负载t-PA基因的生物支架，包括支架、覆盖在支架表面的基底层，覆盖在基底层表面的基因层，以及在支架外表面的封涂层；所述基底层由溶液A组成，所述溶液A为：每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制；所述基因层由透明质酸涂层隔开的白蛋白纳米粒层组成，所述白蛋白纳米粒层由t-PA基因质粒的白蛋白纳米溶液组成；所述封涂层由含5％胎牛血清的RPMI1640培养液组成。优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架中，所述白蛋白纳米粒层为两层。优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架中，所述白蛋白纳米溶液有如下方法制备而成：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1M HCI调整pH值至5.5，得溶液A，将1mg t-PA质粒加入溶液A中孵育30min后，在超声场中滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，搅拌，静置2h，减压使残余的乙醇挥发，所得溶液17000r/min离心30min，所得沉淀用双蒸水重悬并用超声波分散成乳胶状，所得为白蛋白纳米溶液。本专利技术的有益效果在于：与现有技术相比，本专利技术负载t-PA基因的生物支架的不锈钢支架表面层模拟血管基底膜物质，可诱导血管内皮快速匍匐支架表面，防治血栓形成；纳米基因层起到缓释和控释基因药物作用；两层纳米粒之间的透明质酸层起到连接层作用，因其带负电荷，纳米粒在酸性环境表面呈正电，通过电荷吸引作用将两层纳米粒牢固结合在一起。最外层为支架纳米基因转染提供良好的微环境。本专利技术的负载t-PA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种负载t‑PA基因的生物支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：白蛋白纳米溶液的制备：以白蛋白和t‑PA基因质粒为原料制备t‑PA基因质粒的白蛋白纳米溶液；涂层支架的制备：a、按每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制支架表面涂层液；b、将支架经无菌处理后，置于经超声波震荡处理的支架表面涂层液中，于25℃条件下孵育1h后无菌风干，在直径3mm的球囊上压模成型，得涂层支架；步骤2：将步骤1所得涂层支架浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30‑40min，晾干；步骤3：将步骤2所得涂层支架浸于透明质酸液中孵育30‑40min，晾干，浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30‑40min，晾干；步骤4：将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t‑PA基因的生物支架。

【技术特征摘要】
1.一种负载t-PA基因的生物支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：
白蛋白纳米溶液的制备：以白蛋白和t-PA基因质粒为原料制备t-PA基因质
粒的白蛋白纳米溶液；
涂层支架的制备：a、按每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤
维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制支架表面涂层液；
b、将支架经无菌处理后，置于经超声波震荡处理的支架表面涂层液中，于
25℃条件下孵育1h后无菌风干，在直径3mm的球囊上压模成型，得涂层支架；
步骤2：将步骤1所得涂层支架浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，
晾干；
步骤3：将步骤2所得涂层支架浸于透明质酸液中孵育30-40min，晾干，浸
于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；
步骤4：将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层
封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。
2.根据权利要求1所述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法，其特征在
于，所述支架为316L不锈钢支架网。
3.根据权利要求1所述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法，其特征在
于，所述白蛋白纳米溶液的制备具体为：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水
溶解，用0.1M HCI调整pH值至5.5，得溶液A，将1mg t-PA质粒加入溶液A
中孵育30min后，在超声场中滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴
入0.5％的戊二醛溶液30ul，搅拌，静置2h，减压使残余的乙醇挥发，所得溶液
17000r/min离心30min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：季军，屠洪，吴大方，何霞，刘强，陈小玲，令文萍，
申请(专利权)人：季军，屠洪，
类型：发明
国别省市：广东;44