一种环二肽的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种环二肽的生产方法，属于天然化合物合成技术。采用冷却变温合成及高压高温水相环化技术制备环(组氨酸-脯氨酸)二肽。以组氨酸脯氨酸二肽甲酯的盐酸盐为原料，在含强碱弱酸性盐的水中采用高压高温辅助法合成高品质、高纯度的组氨酸-脯氨酸环二肽，与传统的甲醇回流法相比，省时、高效，产品得率高，无消旋现象发生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于天然化合物的合成
，尤其是指一种环(组氨酸-脯氨酸)二肽的生产方法。
技术介绍
环二肽是由两个氨基酸残基通过一对互补的酰胺键互相连接而形成的一个稳定的六元环结构。由于其具有内在构象的约束作用，环二肽较直链二肽更稳定，不易被蛋白酶水解，在体内的半衰期比相应的二肽分子长。此外，环二肽分子中的两个肽键成为氢键给体和氢键受体，而氢键是药物与受体相互作用的主要方式之一，因此环二肽在药物化学中是一个非常重要的药效团。环(组氨酸-脯氨酸)二肽[Cyclo(His-Pro)，CHP]是一种内源性环二肽，由促甲状腺素释放激素经焦谷氨酸氨肽酶水解脱去焦谷氨酸后环化而成，广泛分布于人和动物的组织和体液中。CHP可以减缓乙醇的麻醉作用及低体温症状、对抗某些中枢抑制药物的毒副作用，并且能刺激血糖代谢，对Ⅱ型糖尿病人的血糖水平起到一定的控制作用。CHP结构简单,能通过血脑屏障，成为有效治疗糖尿病、吸毒、嗜酒及某些行为疾病的一种短肽类药物。从天然产物中分离提取CHP不仅步骤繁琐且效率低下，因此采用化学合成法合成CHP具有重要的意义。目前CHP的化学合成法主要采用甲醇回流法，即将N-端游离的二肽甲酯在低沸点的甲醇中加热回流合成环二肽。虽然甲醇回流法可以得到较理想的产物得率，但是此法的反应速率很慢，而且会导致各种程度的消旋,使CHP的功效减弱甚至消失。
技术实现思路
本专利技术提供一种环二肽的生产方法,以解决目前甲醇回流法中存在的反应速率很慢，而且会导致各种程度的消旋,使CHP的功效减弱甚至消失的问题。本专利技术采取的技术方案是，包括下列步骤：(一)低温保护氨基酸氨基以L-组氨酸为原料，将其溶于水-四氢呋喃(v/v＝1:2)溶剂中，L-组氨酸的浓度为0.25～0.50mol/L，以二碳酸二叔丁酯[(Boc)2O]为保护剂进行氨基保护，首先配制四氢呋喃-(Boc)2O溶液，其中(Boc)2O浓度为1～1.5mol/L，加到含L-组氨酸的pH8～9的碱水溶液中，His︰(Boc)2O(mol/mol)＝1:(2～2.5)，-5℃～-10℃下搅拌反应15～30min，搅拌速率80～100r/min，然后升温至30℃～40℃搅拌反应4～6h，反应结束后于温度38℃、真空度为-0.1MPa条件下减压脱除有机溶剂，剩余物1:(18～20)(g/mL)比例加水溶解，用乙醚洗涤2～3次，每次洗涤时水相：乙醚相(v/v)＝2：1，脱除残留的(Boc)2O，然后于0℃条件下用质量浓度为50％的柠檬酸溶液调酸至pH3～4，得到游离的Nim-Boc-Nα-Boc-L-组氨酸，最后用乙酸乙酯萃取3～4次，每次萃取时水相/乙酸乙酯相(v/v)＝1︰1，萃取氨基被保护的后L-组氨酸，然后再于温度35℃、真空度为-0.1MPa条件下减压蒸干脱除乙酸乙酯，得到氨基已被保护的L-组氨酸，此过程将L-组氨酸的N-端氨基和侧链咪唑基用叔丁氧羰基(Boc-)保护，生成Nim-Boc-Nα-Boc-L-组氨酸；(二)低温保护氨基酸羧基将L-脯氨酸悬浮于无水甲醇中，L-脯氨酸在无水甲醇中浓度为0.2～0.5mol/L，冷却到0℃，向体系中通入干燥HCl气体，通气搅拌反应2～3h，搅拌速率为80～100r/min，反应结束后于温度35℃、真空度为-0.1MPa条件下减压蒸发除去甲醇和过量的HCl，得到C-端羧基被保护的L-脯氨酸甲酯盐酸盐；(三)形成肽键以二氯甲烷(DCM)为溶剂，将经过(一)、(二)制备的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸(Nim-Boc-Nα-Boc-L-His)溶于DCM，调整Nim-Boc-Nα-Boc-L-His在DCM中浓度为0.03～0.06mol/L的溶液，然后加入1-羟基苯并三氮唑HOBt制成混合液，将N'N-二环己基碳二亚胺DCC用DCM进行溶解，配制成DCC浓度为0.3～0.5mol/L的溶液，然后于-5℃～-10℃条件下将该溶液滴加到上述混合液中，搅拌反应20～30min，搅拌速率为80～100r/min，建立肽键形成反应体系，用等质量的三乙胺中和脯氨酸甲酯盐酸盐(Pro-OMe·HCl)，然后用定量滤纸过滤，滤液加入到上述肽键形成反应体系中，最后加入少量的三乙胺调整反应体系pH7～8后，然后升温至35～40℃，以80～100r/min速率继续搅拌反应2～4h，反应底物配比为：(Nim-Boc-Nα-Boc-L-His)︰(Pro-OMe·HCl)︰DCC︰HOBt(mol/mol)＝1︰(1.4～2.0)︰(1.4～2.0)︰(1.4～2.0)，反应结束后溶液用定量滤纸过滤，以除去副产物N,N’-二环己基脲(DCU)，然后于温度26～30℃、真空度为-0.1MPa条件下减压浓缩，得到的浓缩物用乙酸乙酯溶解溶解，浓缩物︰乙酸乙酯(g/mL)＝1:(25～30)，过滤脱除残余DCU，滤液依次用饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3溶液洗涤2～5次，每次乙酸乙酯相︰饱和NaCl或饱和NaHCO3溶液(v/v)＝3︰(1～2)，最后用饱和NaCl洗至中性，除去剩余的DCU以及HOBt，然后采用硅胶柱层析纯化，硅胶柱填料为粒度200～300目硅胶，洗脱剂为石油醚︰乙酸乙酯(v/v)＝8︰(2～3)，得到精制的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酸甲酯(Nim-Boc-Nα-Boc-L-His-Pro-OMe)；(四)氨基酸被保护氨基与羧基的选择性脱除称取(三)制备的Nim-Boc-Nα-Boc-L-His-Pro-OMe溶于乙酸乙酯中，调整Nim-Boc-Nα-Boc-L-His-Pro-OMe浓度为0.1～0.3mol/L，于0℃条件下通入干燥的HCl气体，搅拌反应30～45min，搅拌速率80～100r/min，反应结束后于温度35℃、真空度为-0.1MPa条件下减压蒸脱溶剂，脱除Boc-保护基，得到保留C-端保护基的L-组氨酸-L-脯氨酸甲酯的盐酸盐；(五)高温高压水相环化制备环二肽将L-组氨酸-L-脯氨酸甲酯盐酸盐(L-His-L-Pro-OMe·2HCl)悬浮于水中，配制成L-His-L-Pro-OMe·2HCl浓度为0.01～0.05mol/L的悬浮液，用NaHCO3中和至pH6.0，释放游离的L-组氨酸-L-脯氨酸甲酯，然后将溶液密封，在温度130℃～136℃、压力0.17～0.23MPa条件下进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环二肽的生产方法，其特征在于包括下列步骤：(一)低温保护氨基酸氨基以L‑组氨酸为原料，将其溶于水‑四氢呋喃(v/v＝1:2)溶剂中，L‑组氨酸的浓度为0.25～0.50mol/L，以二碳酸二叔丁酯[(Boc)2O]为保护剂进行氨基保护，首先配制四氢呋喃‑(Boc)2O溶液，其中(Boc)2O浓度为1～1.5mol/L，加到含L‑组氨酸的pH8～9的碱水溶液中，His︰(Boc)2O(mol/mol)＝1:(2～2.5)，‑5℃～‑10℃下搅拌反应15～30min，搅拌速率80～100r/min，然后升温至30℃～40℃搅拌反应4～6h，反应结束后于温度38℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压脱除有机溶剂，剩余物1:(18～20)(g/mL)比例加水溶解，用乙醚洗涤2～3次，每次洗涤时水相：乙醚相(v/v)＝2：1，脱除残留的(Boc)2O，然后于0℃条件下用质量浓度为50％的柠檬酸溶液调酸至pH3～4，得到游离的Nim‑Boc‑Nα‑Boc‑L‑组氨酸，最后用乙酸乙酯萃取3～4次，每次萃取时水相/乙酸乙酯相(v/v)＝1︰1，萃取氨基被保护的后L‑组氨酸，然后再于温度35℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压蒸干脱除乙酸乙酯，得到氨基已被保护的L‑组氨酸，此过程将L‑组氨酸的N‑端氨基和侧链咪唑基用叔丁氧羰基(Boc‑)保护，生成Nim‑Boc‑Nα‑Boc‑L‑组氨酸；(二)低温保护氨基酸羧基将L‑脯氨酸悬浮于无水甲醇中，L‑脯氨酸在无水甲醇中浓度为0.2～0.5mol/L，冷却到0℃，向体系中通入干燥HCl气体，通气搅拌反应2～3h，搅拌速率为80～100r/min，反应结束后于温度35℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压蒸发除去甲醇和过量的HCl，得到C‑端羧基被保护的L‑脯氨酸甲酯盐酸盐；(三)形成肽键以二氯甲烷(DCM)为溶剂，将经过(一)、(二)制备的N(im)‑叔丁氧羰基‑N(α)‑叔丁氧羰基‑L‑组氨酸(Nim‑Boc‑Nα‑Boc‑L‑His)溶于DCM，调整Nim‑Boc‑Nα‑Boc‑L‑His在DCM中浓度为0.03～0.06mol/L的溶液，然后加入1‑羟基苯并三氮唑HOBt制成混合液，将N'N‑二环己基碳二亚胺DCC用DCM进行溶解，配制成DCC浓度为0.3～0.5mol/L的溶液，然后于‑5℃～‑10℃条件下将该溶液滴加到上述混合液中，搅拌反应20～30min，搅拌速率为80～100r/min，建立肽键形成反应体系，用等质量的三乙胺中和脯氨酸甲酯盐酸盐(Pro‑OMe·HCl)，然后用定量滤纸过滤，滤液加入到上述肽键形成反应体系中，最后加入少量的三乙胺调整反应体系pH7～8后，然后升温至35～40℃，以80～100r/min速率继续搅拌反应2～4h，反应底物配比为：(Nim‑Boc‑Nα‑Boc‑L‑His)︰(Pro‑OMe·HCl)︰DCC︰HOBt(mol/mol)＝1︰(1.4～2.0)︰(1.4～2.0)︰(1.4～2.0)，反应结束后溶液用定量滤纸过滤，以除去副产物N,N’‑二环己基脲(DCU)，然后于温度26～30℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压浓缩，得到的浓缩物用乙酸乙酯溶解溶解，浓缩物︰乙酸乙酯(g/mL)＝1:(25～30)，过滤脱除残余DCU，滤液依次用饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3溶液洗涤2～5次，每次乙酸乙酯相︰饱和NaCl或饱和NaHCO3溶液(v/v)＝3︰(1～2)，最后用饱和NaCl洗至中性，除去剩余的DCU以及HOBt，然后采用硅胶柱层析纯化，硅胶柱填料为粒度200～300目硅胶，洗脱剂为石油醚︰乙酸乙酯(v/v)＝8︰(2～3)，得到精制的N(im)‑叔丁氧羰基‑N(α)‑叔丁氧羰基‑L‑组氨酸‑L‑脯氨酸甲酯(Nim‑Boc‑Nα‑Boc‑L‑His‑Pro‑OMe)；(四)氨基酸被保护氨基与羧基的选择性脱除称取(三)制备的Nim‑Boc‑Nα‑Boc‑L‑His‑Pro‑OMe溶于乙酸乙酯中，调整Nim‑Boc‑Nα‑Boc‑L‑His‑Pro‑OMe浓度为0.1～0.3mol/L，于0℃条件下通入干燥的HCl气体，搅拌反应30～45min，搅拌速率80～100r/min，反应结束后于温度35℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压蒸脱溶剂，脱除Boc‑保护基，得到保留C‑端保护基的L‑组氨酸‑L‑脯氨酸甲酯的盐酸盐；(五)高温高压水相环化制备环二肽将L‑组氨酸‑L‑脯氨酸甲酯盐酸盐(L‑His‑L‑Pro‑OMe·2HCl)悬浮于水中，配制成L‑His‑L‑Pro‑OMe·2HCl浓度为0.01～0.05mol/L的悬浮液，用NaHCO3中和至pH6.0，释放游离的L‑组氨酸‑L‑脯氨酸甲酯，然后将溶液密封，在温度130℃～136℃、压力0.17～...

【技术特征摘要】
1.一种环二肽的生产方法，其特征在于包括下列步骤：
(一)低温保护氨基酸氨基
以L-组氨酸为原料，将其溶于水-四氢呋喃(v/v＝1:2)溶剂中，
L-组氨酸的浓度为0.25～0.50mol/L，以二碳酸二叔丁酯[(Boc)2O]为保
护剂进行氨基保护，首先配制四氢呋喃-(Boc)2O溶液，其中(Boc)2O
浓度为1～1.5mol/L，加到含L-组氨酸的pH8～9的碱水溶液中，His
︰(Boc)2O(mol/mol)＝1:(2～2.5)，-5℃～-10℃下搅拌反应15～30min，
搅拌速率80～100r/min，然后升温至30℃～40℃搅拌反应4～6h，反
应结束后于温度38℃、真空度为-0.1MPa条件下减压脱除有机溶剂，
剩余物1:(18～20)(g/mL)比例加水溶解，用乙醚洗涤2～3次，每
次洗涤时水相：乙醚相(v/v)＝2：1，脱除残留的(Boc)2O，然后于0
℃条件下用质量浓度为50％的柠檬酸溶液调酸至pH3～4，得到游离
的Nim-Boc-Nα-Boc-L-组氨酸，最后用乙酸乙酯萃取3～4次，每次萃
取时水相/乙酸乙酯相(v/v)＝1︰1，萃取氨基被保护的后L-组氨酸，
然后再于温度35℃、真空度为-0.1MPa条件下减压蒸干脱除乙酸乙
酯，得到氨基已被保护的L-组氨酸，此过程将L-组氨酸的N-端氨基
和侧链咪唑基用叔丁氧羰基(Boc-)保护，生成Nim-Boc-Nα-Boc-L-
组氨酸；
(二)低温保护氨基酸羧基
将L-脯氨酸悬浮于无水甲醇中，L-脯氨酸在无水甲醇中浓度为
0.2～0.5mol/L，冷却到0℃，向体系中通入干燥HCl气体，通气搅拌
反应2～3h，搅拌速率为80～100r/min，反应结束后于温度35℃、真
空度为-0.1MPa条件下减压蒸发除去甲醇和过量的HCl，得到C-端羧
基被保护的L-脯氨酸甲酯盐酸盐；
(三)形成肽键
以二氯甲烷(DCM)为溶剂，将经过(一)、(二)制备的N(im)-
叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸(Nim-Boc-Nα-Boc-L-His)溶于

\tDCM，调整Nim-Boc-Nα-Boc-L-His在DCM中浓度为0.03～0.06mol/L
的溶液，然后加入1-羟基苯并三氮唑HOBt制成混合液，将N'N-二
环己基碳二亚胺DCC用DCM进行溶解，配制成DCC浓度为0.3～
0.5mol/L的溶液，然后于-5℃～-10℃条件下将该溶液滴加到上述混合
液中，搅拌反应20～30min，搅拌速率为80～100r/min，建立肽键形
成反应体系，用等质量的三乙胺中和脯氨酸甲酯盐酸盐
(Pro-OM...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳荣，刘婷婷，王大为，张雁南，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22