用于从生物样品中采集和分离核酸的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及用于采集、储存、运输、分离和检测获自样品的大分子例如核酸序列的工具、组合物和方法。所述组合物为用于杀死或灭活病原体、灭活酶和从用于进一步加工和/或分析而制备的样品释放核酸的一步配方。特别地，本发明专利技术提供帮助核酸、基因和基因组浓缩、提取、分离和分析的单一的一步样品采集和运输配方。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对相关申请的引用本申请要求于2012年3月28日提交的标题为“用于从生物样品中采集和分离大分子的组合物和方法”的美国临时申请号61/616,676的优先权，该申请整体通过引用特别地予以结合。专利
本专利技术涉及用于采集、运输和储存包含核酸群的生物样品的工具、组合物和方法，特别地涉及包含帮助样品中大分子例如核酸和蛋白质分离和浓缩的组分例如聚合物纤维或小珠的工具、方法和组合物。专利技术背景无论在远距离场所、医生办公室或实验室中取样，维持生物样品中核酸(特别是获自人类患者的诊断样品中包含的那些)的完整性的能力常常决定核酸是否能被成功分析。通常，生物样品中的核酸在环境温度时将迅速降解和/或变性。尽管经过一段时间仍产生一些程度的降解，但样品常常储存在冻结温度以下以保存其稳定性和序列保真度用于后来的鉴定。当样品在远距离场所，或与医生办公室或实验室环境有显著距离，特别是冰箱/冰库条件可能受限或不能获得的地方采集时，这一问题被放大。当用于下游分析的所需核酸包含核糖核酸(RNA) (特别易于被内源或外源核酸酶活性降解)时，与生物样品采集和处理相关的问题进一步加深。存在可市售获得样品运输系统，但需要冷冻和/或专门的用于将生物样品从采集点运输到分析点的运输介质。该介质对样品可储存的时间强加不可能的限制，或需要在使某些采集不可行的低温下的连续样品维持。并且，关于在储存和运输所采集样品中所使用的试剂的处理和/或储存，常常存在额外的顾虑。例如，试剂本身经常需要低温或其它特别护理以维持稳定性。由于这些稳定性问题，例如，将试剂运输至一个场所、使用前在该场所储存以及将生物样品和试剂运回检验地点成为主要的关注问题。当用生物样品工作时，另一个顾虑为向个人和环境释放传染因子以及还污染生物样品自身的风险。参与采集、转移和检验过程的个人(包括无辜旁观者)具有暴露在高危险接触传染物中的危险。因此，所需的安全措施通常增加了将此种样品从一个位置移动至另一个位置所需的费用和精力。用于病原体检测的临床实验室方法为劳动密集型、昂贵的过程，需要具有特别经验的高度知识渊博和专业的科学工作者。大部分临床诊断实验室使用传统培养方法，其通常需要许多天以培养病毒——甚至更长时间以培养一些其它靶细菌。此外，传统培养需要采集、运输以及实验室繁殖和处理潜在传染性生物因子例如Ebola、禽流感、严重急性呼吸道综合征(SARS)以及许多其它。聚合酶链反应(PCR)及其后的实时PCR的出现彻底改变了分子诊断。相对于传统培养和分离方法需要数天，使用例如定量实时PCR (qPCR)或逆转录酶PCR (RT-PCR)和定量、实时、逆转录酶PCR (qRT-PCR)测定的基于核酸的检测平台可在数小时内交付结果，使分子检测方法成为现代诊断实验室分析的支柱。检测化学的新近改良，例如，新型和改良的报告/猝灭荧光剂、小沟结合剂(MGB) (TaqMan MGBTM, Applied Biosystems; 对于一般性参考，还参见例如，Baraldi等,Pure Appl. Chem., 75(2-3):187-194, 2003)和稳定的扩增试剂为更灵敏和高特异性核酸检测测定铺好了道路，并且已经证明比过时的基于细胞培养的方法更及时、强健和经济。其它核酸检测策略例如转录-介导的扩增、连接酶链反应(LCR)和所谓的“芯片上的实验室”的多路测定的进展也促进了临床实验室中从培养瓶到微阵列的转换。几家商业公司(例如，Qiagen [Valencia, CA, USA]、Roche Applied Science [Indianapolis, IN, USA]、Gen-Probe [San Diego, CA, USA]和bioMérieux [Durham, NC, USA])已经开发了使从样品分离到分子分析的核酸提取过程自动化的仪器。例如，Tigris DTS? (Gen-Probe, San Diego, CA, USA)使整个检测过程自动化，并且在2004年底获得美国食品和药物管理局(FDA)批准用于使用Gen-Probe的APTIMA COMBO-2?扩增核酸检验(NAT)测定同时检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)。鉴于现代检测和测定系统中对高质量核酸样品的需求，本领域中需要无需冷冻或冰冻或特殊处理而维持多种生物样品和样本中所包含核酸的完整性和质量的安全和温和的采集、储存和运输系统。而且，当样品为有害或致病生物时，这一需要尤为突出。此外，目前存在对更便宜和更便利的采集/运输/储存介质的需求：其(i) 使工作者和其它对病原体暴露的风险降到最低；(ii) 提供浓缩；(iii) 帮助生物样品在环境温度下更长时间地便利运输；和(iv) 使得样品可按照需要适当地分析多种大分子，包括核酸、基因和基因组。专利技术简述本专利技术包括新型和有用的工具、组合物以及制造和使用它们的方法，其有利地改良传统样品采集，使得所采集的样品中的大分子得以保存用于分析和鉴定。本专利技术的一个实施方案涉及一种组合物，优选含水的，其包含：一种或多种离液剂、一种或多种洗涤剂、一种或多种还原剂、一种或多种螯合剂、一种或多种缓冲剂和一种或多种核酸捕获基质(NACM)材料，一起以当与疑似包含细胞、蛋白质、核酸酶和核酸序列的样品接触时足以裂解膜、变性蛋白质、灭活核酸酶、杀死细胞例如病原体和/或任何其它活物质的量存在。优选组合物至少不大量降解样品的核酸序列，使得核酸序列保持可检测和/或可鉴定。当样品与组合物接触时，可检测的核酸序列包括，例如，病原体衍生的序列、癌症标志物序列、特定基因和基因组。优选一种或多种离液剂以约0.5 M-约0.6 M的量存在；一种或多种洗涤剂以约0.1%-约1% (wt./vol.)的量存在；一种或多种还原剂以约0.05 M-约0.3 M的量存在；一种或多种螯合剂以约0.01 mM-约1 mM的量存在；一种或多种缓冲剂以约0.0001%-约0.3% (wt./vol.)或约1 mM-约1 M的量存在；以及一种或多种NACM以每100 μL约1 ng-10 μg的量存在。还优选，一种或多种离液剂包括硫氰酸胍、异氰酸胍、盐酸胍或其任何组合，一种或多种还原剂包括2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、二甲基亚砜、三(2-羧乙基)膦或其任何组合，一种或多种洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、脱氧胆酸钠、胆酸钠、烷基苯磺酸钠、N-月桂酰肌氨酸或其任何组合，一种或多种螯合剂包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N-双(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或其任何组合；或b) 一种或多种表面活性剂包括有机硅聚合物、聚山梨醇酯或其任何组合，一种或多种缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、1,3-双(三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含水组合物，包含：一种或多种离液剂；一种或多种洗涤剂；一种或多种还原剂；一种或多种螯合剂；一种或多种缓冲剂，和一种或多种核酸捕获基质材料，一起以当疑似包含所选核酸序列的样品与组合物接触时足以变性蛋白质、灭活核酸酶、杀死病原体并且不降解所述样品的酶的量存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.28 US 61/6166761.一种含水组合物，包含：
一种或多种离液剂；
一种或多种洗涤剂；
一种或多种还原剂；
一种或多种螯合剂；
一种或多种缓冲剂，和
一种或多种核酸捕获基质材料，
一起以当疑似包含所选核酸序列的样品与组合物接触时足以变性蛋白质、灭活核酸酶、杀死病原体并且不降解所述样品的酶的量存在。
2.权利要求1的组合物，进一步包括疑似包含微生物或细胞的样品。
3.权利要求1的组合物，其中：a) 一种或多种离液剂以约0.5 M-约6 M的量存在；b) 一种或多种洗涤剂以约0.1%-约1% (wt./vol.)的量存在；c) 一种或多种还原剂以约0.05 M-约0.3 M的量存在；d) 一种或多种螯合剂以约0.01 mM-约1 mM的量存在；e) 一种或多种缓冲剂以约0.0001%-约0.3% (wt./vol.)或约1 mM-约1M的量存在；和(f) 一种或多种NACM材料以每100 μL约1 ng-10 μg的量存在。
4.权利要求3的组合物，其中一种或多种离液剂包括硫氰酸胍、异氰酸胍、盐酸胍或其任何组合。
5.权利要求3的组合物，其中一种或多种洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、脱氧胆酸钠、胆酸钠、烷基苯磺酸钠、N-月桂酰肌氨酸或其任何组合。
6.权利要求3的组合物，其中一种或多种还原剂包括2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、二甲基亚砜、三(2-羧乙基)膦或其任何组合。
7.权利要求3的组合物，其中a) 一种或多种螯合剂包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N-双(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或其任何组合；或b) 一种或多种表面活性剂包括有机硅聚合物、聚山梨醇酯或其任何组合。
8.权利要求3的组合物，其中一种或多种缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、碳酸氢盐、磷酸盐或其任何组合。
9.权利要求3的组合物，其中一种或多种核酸捕获基质材料包括用核酸结合物质包覆的瓷、陶瓷、塑料或玻璃珠。
10.权利要求3的组合物，进一步包括一种或多种短链烷醇。
11.权利要求10的组合物，其中所述一种或多种短链烷醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇或其任何组合，以约1-约25% (vol./vol.)的量存在。
12.权利要求3的组合物，缓冲至pH约6-约7。
13.权利要求3的组合物，进一步包含包括有机硅聚合物或聚山梨醇酯的消泡剂。
14.权利要求1的组合物，进一步包含裸露的RNA、DNA或其组合。
15.权利要求1的组合物，其中：
一种或多种离液剂包括约4 M硫氰酸胍；
一种或多种螯合剂包括约30 mM柠檬酸钠；
一种或多种洗涤剂包括约0.25% (wt./vol.)十二烷基硫酸钠和约0.25% (wt./vol.) N-月桂酰肌氨酸钠盐；
一种或多种还原剂包括约0.1 M 2-巯基乙醇；并进一步包含包括约0.1%有机硅聚合物 (wt./vol.)的消泡剂；和
一种或多种核酸捕获基质材料包括用核酸结合物质包覆的聚合物、瓷、陶瓷、塑料、聚合物或玻璃珠，或其组合。
16.权利要求15的方法，其中样品包含与组合物接触后被物理裂解的一种或多种病毒、细菌、真菌、动物或植物细胞。
17.在疑似包含动物或人细胞或微生物的生物样品中...

【专利技术属性】
技术研发人员：GW费希尔，LT道姆，
申请(专利权)人：长角牛疫苗和诊断有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US