本发明专利技术发现了一种筛选间变性淋巴瘤激酶抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)间变性淋巴瘤激酶抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验；(2)阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分别加入2μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，加入2ul ATP开始反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10μl终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药IC50；(3)高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用Biomek NXP自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z因子。本发明专利技术的优点主要有：1)简便快捷；2)灵敏度高；3)结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了间变性淋巴瘤 激酶（ALK)激酶抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对ALK激酶抑制活性的高通量检 测。
技术介绍
ALK是一个受体型蛋白酪氨酸磷酸激酶，它能够接受细胞外的信号，调控着细胞的 生长、分化、存活和转化。在结构上，ALK包括一个细胞外的配体结合区，一个跨膜区和细胞 内的结构域。ALK的cDNA全长6226bp，编码了一个177kDa的蛋白质，经过编译后修饰的 ALK蛋白质分子量接近200?220kDa。ALK是一个单链跨膜蛋白质，含有1620个氨基酸残 基。ALK的细胞膜外部分包含1030个氨基酸残基，形成了几个重要的结构。跨膜区包括28 个氨基酸残基，紧接着是一个由66个氨基酸残基组成的关节膜片段。最初，人们是在间变 性大细胞淋巴瘤中以一种激活的融合癌基因的形式发现了ALK，随后连续的研究在多种癌 症中发现了ALK的融合形式，其中包括系统性组织异常增生、炎性肌纤维细胞瘤、非小细胞 肺癌等。ALK在多种癌症中的突变和异常的活性，已经使它成为一个治疗ALK阳性癌症的药 物靶点。因此，研究ALK激酶抑制剂具有重大意义。 时间分辨突光技术（time-resolvedfluorescence,TRF)是基于镧系元素如铕 (Eu)、钐（Sm)、镝（Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之 间距离小于l〇nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均 相时间分辨突光（homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio 公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短（一般为几毫 秒），为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能 量供体，受体经过别藻蓝蛋白（allophycocyanin)或突光素修饰，供体在能量转移时就可 以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消 失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧 光引起的背景干扰。 目前，已有多种ALK激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选ALK激酶抑制 齐[J，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别 是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的ALK激酶抑制剂高通量筛 选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。 本专利技术的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外ALK激酶抑制剂高通量 筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制ALK激酶活性的候选化合物。具体步骤如下： 本专利技术利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种ALK激酶抑制剂高通量筛选模 型。 步骤一 ：ALK激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。 步骤二：阳性药验证模型可靠性。 步骤三：高通量筛选模型验证。 【附图说明】： 图1 :ALK激酶浓度梯度优化实验结果。（n=3, [土S) 图2 :ALK激酶温孵时间优化实验结果。（n=3，i土〇 图3 :ALK激酶底物浓度优化实验结果。（n=3，[土S) 图4 :ALK激酶ATP浓度优化实验结果。（n=3, [土S) 图5 :阳性药十字孢碱对ALK激酶的抑制曲线图。（n=3，I土S) 图6 :ALK激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。 图7:高通量筛选Z'值分布。 【具体实施方式】 以下结合【附图说明】本专利技术的【具体实施方式】： 1.ALK激酶抑制剂筛选方法建立 (1)实验材料 ALK激酶检测试剂盒（Cisbio,法国）、ALK激酶（Invitrogen，美国）、ATP(生兴， 中国）、十字孢碱（碧云天，中国）、384低体积白板（Coming,美国）、枪头（Axygen，美国）。 (2)实验步骤 1)进行ALK激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。 2)待测化合物精确称量，加入DMS0溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化 合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1Xl(T3m〇l/L。 3)在反应容器中每孔加入ALK激酶溶液2ill，底物溶液2ill，缓冲液或待筛化合 物4iil，ATP2ill。室温反应1小时。 4)每孔加入Estradiol_XL6655U1，Anti-Estradiol_cryptate5U1，室温孵育 1 小时。 5)利用美国贝克曼库尔特（BeckmanCoulter)公司检测平台HTRF模块分别检测 665nm和610nm处的突光强度。 6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC5Q值，见图5。 7)采集检测信号并绘图，通过信号窗和Z'值确定高通量筛选模型的可靠性，见图 6,7。 2?数据处理 (1)根据公式计算各孔665nm和610nm处突光强度的比值（Ratio665/610); (2)根据公式计算各孔的相对抑制率 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种间变性淋巴瘤激酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1)激酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2)阳性药验证模型可靠性； (3)高通量筛选模型验证。
【技术特征摘要】
1. 一种间变性淋巴瘤激酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 激酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为间变性淋巴瘤激酶。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中进行间变性淋巴瘤激酶浓度梯 度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤⑴可得到最佳反应所需的间变性淋 巴瘤激酶浓度为〇. lng/yl，最佳温孵时间为30min，最佳底物浓度为0. liiM，最...
【专利技术属性】
技术研发人员：严明，张陆勇，胡洁，高鹏，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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