原生动物火鸡组织滴虫(H.MELEAGRIDIS)培养物的生产和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于生产火鸡组织滴虫(H.meleagridis)单菌株培养物的方法，该方法的特征在于以下步骤：(a)提供包含火鸡组织滴虫细胞和野生型菌群的火鸡组织滴虫异生(xenic)培养物，(b)用抗生素混合物处理异生培养物，从而杀灭野生型菌群，(c)离心并洗涤火鸡组织滴虫细胞，(d)控制步骤(b)的有效性，(e)重悬洗涤的火鸡组织滴虫细胞，(f)将一种或多种单菌株添加到重悬的火鸡组织滴虫细胞，以及(g)将一种或多种单菌株和重悬的火鸡组织滴虫细胞一起培养以便获得火鸡组织滴虫的单菌株培养物。本发明专利技术还公开了一种疫苗制剂，其由组织滴虫成分、细菌成分以及药学上可接受的非生物制剂化合物组成，其中所述组织滴虫成分由减毒的火鸡组织滴虫培养物组成，所述细菌成分由一种或多种单菌株的培养物组成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原生动物火鸡组织滴虫（H.MELEAGRIDIS)培养物的生产和 应用
本专利技术涉及原生动物火鸡组织滴虫（Histomonas meleagridis) (H. meleagridis) 培养物的生产和应用。
技术介绍
有鞭毛的原生动物火鸡组织滴虫与禽当中的组织滴虫病（同义词，黑头病）有 关，这是主要发生在火鸡和鸡当中的一种疾病。该疾病的特点是肝脏的坏死性病变， 盲肠壁增厚和溃疡以及硫磺色的粪便。组织滴虫病导致高死亡率，尤其是在火鸡群 中。鸡显示出较高的组织滴虫病耐受性，并且病变通常局限于盲肠中（McDougald, Avian Dis. 49 (2005)，462-476 ;Springer，Exp. Parasitol. 28 (1970)，383-392)。 在欧洲和北美的大多数国家中，在实行有效的药品和食品添加剂中对鞭毛虫的禁 令之后，由于其对禽群所构成的威胁以及与疾病爆发相关的重大经济损失，在过去十年中 增加了对火鸡组织滴虫的科研兴趣。 这种寄生虫火鸡组织滴虫属于毛滴虫目（Trichomonadida)双核内变形虫 科（Dientamoebidae)。原生动物的共同特征包括带有一个鞭毛的副基器（parabasal apparatus)、氢化酶体、以及带有淀粉颗粒或细菌的食物泡（feed vacuole)。这些特征表 明了细菌和原生动物寄生虫之间体外和体内相互作用的高度重要性（Delappe等人，Exp. Parasitol. 2(1953), 79-86)〇 Goedbloed 等人（Avian Dis.6(1962), 302-315)公开了 向组织滴虫培养物中 添加细菌，其中来自火鸡的肝脏提取物被补充有大肠杆菌，以产生火鸡组织滴虫的单栖 (monoxenic)培养物（单栖意思是单一的外源性细菌培养物被添加到含有所有天然存在 于肝脏材料的细菌的活检材料中，如大肠杆菌或球菌）。这种单栖培养物已被用于建立火鸡 组织滴虫培养物，但是细菌群落生境的存在总被认为对于建立这种培养物是必要的（EP 1 721 965 A);它遵循的是，为了建立火鸡组织滴虫培养物，细菌成分的存在是必不可少的。 不同于Goedbloed等人的报告，对火鸡组织滴虫体外培养的研究表明单菌株 不适合原生动物的连续体外繁殖，所述研究获自现有的培养物，这种培养物含有混合的 火鸡盲肠菌群，连同大肠杆菌或弗罗思特杆菌（Escherichia freundii)的活和死细胞 (Lesser, Helminthol. Soc. Wash. 31 (1964)，265-266)。因此，最近已经质疑单细菌培养物支 持寄生虫体外生长的能力（Hauck等人，J.Parasitol.96(2010)，1-7)。这个问题对于目前 正在研究中的体外培养物非常重要，所有这些体外培养物都含有从中分离出火鸡组织滴虫 的鸟的野生型盲肠菌群（例如，van der Heijden等人，Avian Pathol. 34(2005)，505-508)。 从患病火鸡的排泄物建立克隆原生动物培养物，给原生动物和细菌之间相互作用的连续和 扩展的检查提供了新的机遇（EP 1 721 965 A)。这种克隆培养物对于建立只含单菌株的明 确培养物而言将是一个良好的开端，或许也使得能够进行特定的细菌交换。 另一方面，抗火鸡组织滴虫感染的疫苗需要安全的抗原（Lund等人，Exp. Parasitol. 18 (1966)，403-407)。一种用于提供安全抗原的方法是提供用于接种的 减毒培养物。最近已经能够制得减毒的火鸡组织滴虫培养物（Liebhart等人，Avian Pathol. 39(2010)，399-403 ;Liebhart 等人，Poultry Sci. 90(2011)，996-1003 ;Hess 等人， Vaccine 26(2008)，4187-4193)。然而，这样的培养物仍然源自天然来源，例如通过使用显 微操作的个体化（Hess等人，Parasitol. 133(2006)，547-554 ;(更普遍的：）Clark等人， Clin. Microb. Rev. 15(2002)，329-341)，因此还含有天然来源的菌群。最近，还使得提供火 鸡组织滴虫的克隆培养物成为可能（EP 1 721 965 A)，然而虽然这些培养物相对于组织滴 虫而言是克隆的，这些克隆培养物甚至仍然含有仅粗略明确其性质的混合细菌培养物。 对于疫苗的市场授权，在兽医领域中同样需要有效成分的明确组成。因此，通常 不可能注册并使用不明确的细菌组成的培养物（这包括单栖培养物）用于工业应用（如 Goedbloed等人，1962报道的）。因此，有必要提供一种药物组合物，其不仅包含减毒的火鸡 组织滴虫细胞，而且相对于细菌成分而言还是均匀设计的。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是建立一种明确的火鸡组织滴虫培养物，其具有明确的 细菌成分，所述细菌成分缺乏野生型的细菌环境。更具体地，本专利技术的一个目的是调查 是否有可能提供一种其中只存在一种（单一）菌株的火鸡组织滴虫培养物，以及是否有可 能用一种或多种其它菌株替代或补充这种株来获得明确定义的火鸡组织滴虫培养物，在其 中不仅火鸡组织滴虫成分是明确定义的（例如，作为克隆和/或减毒培养物），细菌成分也 是明确定义的，从而允许利用火鸡组织滴虫的减毒株来进行适当的检验和注册针对抗火鸡 组织滴虫的工业上可应用的疫苗。这将使得能够提供抗火鸡组织滴虫的工业上可应用的疫 苗，这是本专利技术的核心目的。这种明确定义的火鸡组织滴虫/细菌培养物也将有利于调查 火鸡组织滴虫在某些细菌存在时的生长行为，以及分析寄生虫和细菌在体外和体内之间的 相互作用。 因此，本专利技术提供了一种用于生产火鸡组织滴虫OLmeleagridiS)单菌株培养物 的方法，特征在于以下步骤： (a)提供包含火鸡组织滴虫细胞和野生型菌群的火鸡组织滴虫的异生培养物 (xenic culture)， (b)用抗生素混合物处理异生培养物，从而杀灭野生型菌群， (C)离心并洗涤火鸡组织滴虫细胞， (d)控制步骤（b)的有效性， (e)重悬洗涤的火鸡组织滴虫细胞， (f)向重悬的火鸡组织滴虫细胞中添加一种或多种单菌株，以及 (g)将一种或多种单菌株和重悬的火鸡组织滴虫细胞一起培养以便获得火鸡组织 滴虫的单菌株培养物。 采用本专利技术，首次在液体基质中提供了火鸡组织滴虫的培养物，其具有明确的细 菌成分，其中野生型菌群被完全除去并且被替换为一种或多种单菌株。在火鸡组织滴虫 的克隆培养物中，通过利用各种抗生素选择性破坏初始细菌将排泄物菌群替换成明确的菌 株，同时保持鞭毛虫活着。在本专利技术的过程中，还证明能够无需明显损害原生动物的细胞来 进行这种细菌破坏。发现原生动物寄生虫的生长依赖于细菌，尤其是依赖细菌的能量代谢。 发现大肠杆菌强烈支持寄生虫的生长，而鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium)和绿 脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)效率较低，但在本专利技术的范围内仍然良好地发挥作 用。共聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产火鸡组织滴虫(H.meleagridis)单菌株培养物的方法，该方法的特征在于以下步骤：(a)提供包含火鸡组织滴虫细胞和野生型菌群的火鸡组织滴虫的异生培养物，(b)用抗生素混合物处理异生培养物，从而杀灭野生型菌群，(c)离心并洗涤火鸡组织滴虫细胞，(d)控制步骤(b)的有效性，(e)重悬洗涤的火鸡组织滴虫细胞，(f)向重悬的火鸡组织滴虫细胞中添加一种或多种单菌株，以及(g)将一种或多种单菌株和重悬的火鸡组织滴虫细胞一起培养以便获得火鸡组织滴虫的单菌株培养物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.02 EP 12174582.21. 一种用于生产火鸡组织滴虫化.meleagridis)单菌株培养物的方法，该方法的特征 在于W下步骤： (a)提供包含火鸡组织滴虫细胞和野生型菌群的火鸡组织滴虫的异生培养物， 化）用抗生素混合物处理异生培养物，从而杀灭野生型菌群， (C)离也并洗涂火鸡组织滴虫细胞， (d) 控制步骤化）的有效性， (e) 重息洗涂的火鸡组织滴虫细胞， (f) 向重息的火鸡组织滴虫细胞中添加一种或多种单菌株，W及 (g) 将一种或多种单菌株和重息的火鸡组织滴虫细胞一起培养W便获得火鸡组织滴虫 的单菌株培养物。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述火鸡组织滴虫的异生培养物是火鸡组织滴虫 的克隆培养物，优选通过火鸡组织滴虫培养物的显微操作所建立的克隆培养物。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抗生素混合物包含至少H种不同的抗生 素，优选多利培南、新霉素和利福平的混合物。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过在步骤化）或（C)之后确定菌 落形成单位来进行步骤（d)，W及其中还优选，如果野生型菌群没有完全从火鸡组织滴虫细 胞中除去，则重复步骤（d)。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤讯中添加选自如下 的一种或多种菌株的单菌株培养物：大肠杆菌巧schericia coli)、鼠伤寒沙口氏菌 (Salmonella Typhimurium)、肠炎沙 口氏菌（Salmonella enteritidis)、金黄色葡萄球 菌（Staphlyococ州S aureus)、产气芙膜梭菌（Clostridium perfringens)、粪肠球菌 巧nterococcus faecal is)和 / 或绿賊假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在步骤（f)中添加选自如下的一 种或多种菌株的单菌株培养物：梭菌属，优选产气芙膜梭菌，尤其是产气芙膜梭菌野生株 PA10/2010 ;肠球菌属，优选粪肠球菌，尤其是粪肠球菌ATCC29212 ;沙口氏菌属，优选鼠伤 寒血清型沙口氏菌Salmonella enterica serovar Typhimurium sp.，尤其是鼠伤寒血 清型沙口氏菌ATCC14028 ;沙口氏菌属，优选肠炎血清型沙口氏菌Salmonella enterica serovar化teritidis sp.，尤其是肠炎血清型沙口氏菌ATCC13076;大肠杆菌，尤其是大肠 杆菌ATCC25922、大肠杆菌D册a或者转化有载体pGFPuv的大肠杆菌；葡萄球菌属，优选金 黄色葡萄球菌，尤其是金黄色葡萄球菌野生株PA10/10643和/或假单胞菌属，优选绿賊假 单胞菌，尤其是绿賊假单胞菌ATCC27853。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中火鸡组织滴虫细胞保持在培养基中， 所述培养基含有胎牛血清，优选还含有缓冲液、氨基酸和碳水化合物源，尤其是淀粉。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述火鸡组织滴...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·赫斯，P·加纳，
申请(专利权)人：维也纳兽医大学，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT