一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法技术

一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术的基本过程为将变性蛋白通过凝胶过滤柱，在洗脱的过程中逐渐降低尿素的浓度，进而蛋白可以正确折叠而形成天然活性蛋白。本发明专利技术的方法不仅操作简便，可以获得高纯度的蛋白并保持很高的蛋白或收率，而且可以显著提高蛋白的生物活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
,涉及牛蛇抗血栓酶kfpase的复性方法。
技术介绍
血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康，是导致死亡率最高的病因之一。在过去的几十年中，已经开发了针对血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步骤而起作用的基础和临床药物，但是很多抗血栓药物经常被包括低血压、出血等系统性的副作用所限制，因此，需要开发新型的更具潜力和特异性的抗血栓药物。 牛虻抗血栓酶kfpase为一种单链蛋白，其表观分子量为27kDa。实验表明牛虻抗血栓酶kfpase具有明显的抗静脉血栓的作用。该工作对有潜力开发成为新型单组份抗血栓药物的牛虻抗血栓酶kfpase进行了较为系统的理化性质研究，为该酶的进一步开发和研究奠定了基础。 原核表达系统作为一种成熟的蛋白表达系统，因其表达量高，操作简便和成本较低一直以来都受到工业化生产的青睐。因此借助大肠杆菌系统进行基因工程重组表达具有成本低，大规模发酵容易等优点，但重组蛋白在大肠杆菌系统中基本以包涵体形式表达，表达产物不具有生物活性，往往需要进行繁琐的蛋白质复性实验才能获得部分活性。蛋白质在折叠复性中存在一个难以调和的矛盾，那就是蛋白质的折叠和聚集是个竞争过程。当疏水基团的结合发生在在蛋白质内时即为折叠，发生在分子间时就为聚集。后者是个不可逆的过程，往往形成不溶性沉淀。蛋白质的折叠是单分子的一级反应，聚集是双分子或者多分子反应，通常为二级乃至更高级的反应，因此随着蛋白质浓度的提高聚集的倾向将大于折叠的倾向。基因工程的产业化首先要求能在高浓度下复性，蛋白浓度过低无疑会增加后处理的繁琐，提高成本；其次，要保证高的活性收率，即复性的产物与天然结构完全相同；再次，需要高的蛋白收率，尽量减少蛋白质折叠过程中的聚集沉淀。 蛋白质复性的经典方法一般采用稀释和透析法，前者将变性蛋白直接加入复性缓冲液，高蛋白浓度下往往形成大量沉淀，因而复性时要求很低的蛋白质浓度，而后者操作繁琐，不利于放大。超滤法复性时可以讲变性剂用复性缓冲液连续置换，使变性剂浓度缓慢降低，而蛋白浓度不会明显降低，而且便于自动化操作，但剪切力可能导致复性好的蛋白重新变性而降低活性收率。其他改进的经典复性方法还有脉冲复性、滴加复性和膜管流加复性，它们均不能从根本上解决聚集沉淀的问题。 近年来，固相复性和层析复性的方法被提出且逐渐受到重视，因为它有如下优越性:减少蛋白质互相聚集的机会，提高蛋白质复性浓度；便于去除变性剂；打破复性变性反应平衡，使复性反应持续进行；使复性和纯化同时进行；便于自动化、规模化生产。 凝胶过滤层析是一种在蛋白分离纯化领域常用的技术，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服稀释复性和透析复性的缺点，为了提高蛋白的活性同时又提高了蛋白的收率，而且变性蛋白在高浓度下复性，不易产生沉淀的目的，从而提供一种操作简单、利用凝胶过滤层析复性蛋白的方法。 本专利技术的方法利用凝胶过滤层析复性蛋白的，包括如下步骤实现的: (I)柱平衡:用流动相I平衡凝胶过滤柱；泵入5% -10%柱体积的流动相II ;其中流动相I为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(TriS-HCl) 20-50mmol / L，pH8.0-9.5，L-精氨酸200-500mmol / L，还原型谷胱甘肽l-3mmol / L，氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol / L，流动相 II为尿素 6-8mol / L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 20-50mmoI / L，ρΗ8.0-9.5，L-精氨酸200_500mmol / L,还原型谷胱甘肽l_3mmol / L,氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol /L ； (2)上样:泵入变性蛋白； (3)洗脱:继续用流动相I洗脱凝胶过滤柱，蛋白在通过凝胶过滤柱时，逐渐将尿素的浓度降低，进而蛋白有足够的时间折叠成天然的形态。 整个复性过程是在AKTA上运行的，所有的流动相使用之前都通过了 0.22 μ m的膜进行过滤，凝胶过滤所选的介质为Superdex75、Superose6或者Sephacryl S-200,步骤(I)中的柱体积为400ml。 本专利技术的步骤⑴中，泵入5% -10%柱体积的流动相II，其目的是为了变性样品上样后，不会因为环境突然改变而发生沉淀。在这个过程中，尿素的浓度会逐渐的降低，使蛋白有一个逐渐适应的过程，从而给蛋白足够的时间进行折叠，最后形成接近天然的形态。 凝胶过滤后收集的蛋白样品透析后，进行抗血小板聚集实验。 【附图说明】 图1为牛蛇抗血栓酶kfpase的Superdex75层析的色谱图，箭头所指为目的蛋白峰 图2为牛蛇抗血栓酶kfpase的Superdex75层析的SDS-PAGE检测结果 【具体实施方式】 实施例1:牛蛇抗血栓酶kfpase在Superdex75柱上进行复性 牛蛇抗血栓酶kfpase基因工程菌发酵后，取30g菌泥，用裂解液(20mmol / LTris-HCl，ρΗ8.0，500mmol / L NaCl，5%甘油，lmmol / L EDTA)重悬，在固液比为 I:30 的条件下，混合成均一的悬液，倒入高压破碎仪(ATS)中进行破碎，继而通过离心分离得到湿的包涵体粗品。 将上述得到的粗包涵体用缓冲液A(20mmol / L Tris-HCl, pH8.0,500mmol / LNaCl)和缓冲液 B(20mmol / L Tris-HCl,pH8.0,500mmol / L NaCl，2mol / L Urea)依次洗涤，得到高纯度包涵体。 取5g高纯度包涵体，以固液比1:40的比例用溶解液(20mmol / LTris-HCl,pH8.0,5mmol / LDTT, 6mol / LUrea)溶解，室温温和搅拌1_2小时，离心得上清液200ml，并用Lowry法测定蛋白浓度。 将400ml 的 Superdex75 层析柱用流动相 I (20mmol / L Tris_HCl,pH8.0, 2mmol /L GSH,0.4mmol / L GSSG, 250mmol/L L-Arg)平衡，泵入 30ml 的流动相 II(6mol / LUrea, 20mmol / LTris-HCl,pH8.0,2mmol / L GSH,0.4mmol / L GSSG,250mmol / L L-Arg)。将溶解的变性牛蛇抗血栓酶kfpase在AKTA prime plus上泵入层析柱,上样结束后,继续用流动相I进行洗脱。 将洗脱获得的样品进行透析，透析液为(20mmol / L Tris-HCl，ρΗ8.0)。 进行抗血小板聚集实验，抑制率与透析复性的样品9%相比，提高了 5.6倍，为51%。 实施例2:牛蛇抗血栓酶kfpase在Superose6柱上进行复本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法，利用凝胶过滤层析进行，包括以下步骤：(1)柱平衡：用流动相I平衡凝胶过滤柱；泵入5％‑10％柱体积的流动相II；其中流动相I为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)20‑50mmol／L，pH8.0‑9.5，L‑精氨酸200‑500mmol／L，还原型谷胱甘肽1‑3mmol／L，氧化型谷胱甘肽0.2‑0.6mmol／L，流动相II为尿素6‑8mol／L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)20‑50mmol／L，pH8.0‑9.5，L‑精氨酸200‑500mmol／L，还原型谷胱甘肽1‑3mmol／L，氧化型谷胱甘肽0.2‑0.6mmol／L；(2)上样：泵入变性蛋白；(3)洗脱：继续用流动相I洗脱凝胶过滤柱，蛋白在通过凝胶过滤柱时，逐渐将尿素的浓度降低，进而蛋白有足够的时间折叠成天然的形态。

【技术特征摘要】
1.一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法，利用凝胶过滤层析进行，包括以下步骤: (1)柱平衡:用流动相I平衡凝胶过滤柱；泵入5%-10%柱体积的流动相II ;其中流动相I为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 20-50mmol / L，pH8.0-9.5，L-精氨酸200-500mmol / L，还原型谷胱甘肽l-3mmol / L，氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol / L，流动相II 为尿素 6-8mol / L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 20-50mmoI / L，ρΗ8.0-9.5，L-精氨酸200_500mmo...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦引林，韩承业，
申请(专利权)人：江苏柯菲平医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32