本发明专利技术克隆了微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)的一个2080bp的蓝光诱导的bZIP类转录因子(NgAUREO1)的全长。该基因包括一个1398bp的ORF，192bp的5’端非编码区和490bp的3’端非编码区，编码465个氨基酸。该基因含有一个bZIP结构域可以结合到特定基因的启动子区域，从而调控特定基因的表达；以及一个LOV结构域可以感受470nm左右的蓝光，进而赋予该基因受蓝光调控的特性。该基因与无隔藻中的aureochromel基因的氨基酸序列相似性为59％。我们构建了该基因的酵母表达载体，并将此基因导入酿酒酵母中，提高了酵母的油脂含量。通过对重组酵母进行蓝光刺激证明了该基因可以蓝光作为开关调节其参与脂肪酸代谢的途径。
【技术实现步骤摘要】
微拟球藻NgAUREOI基因在调控脂肪酸代谢中的应用 一、
： 本专利技术涉及从微拟球藻中克隆了一个新的编码区为1398bp的受蓝光调节的转录 因子相关基因（NgAUREOl)，并证明了该基因在调节脂肪酸代谢中的新功能。 二、
技术介绍
： 随着当今世界能源危机的日趋严重，人们已经逐步把目光从传统的石油化工燃 料，转向生物质能源上。然而生物体油脂含量的高低是影响生物质能源发展的关键问题之 一。已经有许多科学家在这一问题上做了大量的研究。有的通过筛选油脂含量相对较高的 生物体作为原料，但仍无法满足生物质能源的需求；有的将生物体置于缺氮、低温等逆境中 以促进生物体油脂含量的增高，但是这必然导致生物量的降低；还有人提出通过基因工程 对生物体进行改造，使其可以大量积累油脂，然而实验结果多数不尽人意。究其原因主要是 所利用的基因多为调控单一通路的功能基因，其调控范围窄，影响能力弱，从而无法达到理 想的效果。 转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特 异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用可以激 活或抑制某些基因的转录。与基因技术定位于改造单个基因不同，转录因子技术影响一系 列基因的多条代谢路径，这些代谢路径在同时作用下完成正向或者负向的调控。目前这一 技术已经被证实可以促进次生代谢产物在植物细胞中的积累。 Aureochromel于2007年从无隔藻中被发现，研究表明该基因编码的蛋白具有转 录因子功能，可以特异性的结合TGACGT序列。这一序列是典型的S型或D型bZIP的结合位 点。该基因由一个碱性亮氨酸拉链结构域（bZIP)和一个感受蓝光的LOV结构域组成。正 是由于这一特殊的结构赋予了该转录因子受蓝光诱导的特性。研究表明，该基因控制着无 隔藻的分支发育活动。然而未有研究证明该基因具有其他功能。 我们从微拟球藻（Nannochloropsis gaditana)中克隆了一个新的蓝光诱导的 bZIP类转录因子，并命名为NgAUREOl。该基因所编码的蛋白具有一个bZIP结构域用于结 合目的基因启动子区的特异性序列，以及一个可以感受波长为470nm的蓝光的LOV结构域。 该基因与无隔藻中aureochromel的氨基酸序列相似性为59%。我们构建了该基因的酵母 表达载体并将此转录因子导入酿酒酵母中，通过测定酵母脂肪酸的含量，证明了该转录因 子可以促进酵母细胞内油脂含量的增加。我们还通过对转有该基因的酿酒酵母进行蓝光照 射，并测定脂肪酸含量，证明了蓝光可以控制该转录因子参与脂肪酸的合成与分解。 三、
技术实现思路
： 1、克隆了微拟球藻中的蓝光诱导转录因子NgAUREOl 从本实验室所建立的微拟球藻转录组数据库中找到aureochromel基因的片段， 根据该片段设计了两对基因特异性引物（5GSP1，5GSP2和3GSP1，3GSP2)。利用TransZol Plant total RNA提取试剂盒提取微拟球藻RNA，用TransScript RT反转录试剂盒反转录形 成cDNA，通过PCR扩增得到NgAUREOl基因的全长，连接到pMD19-T载体上，导入感受态大肠 杆菌，挑选阳性克隆菌株进行菌液PCR鉴定。最后将带有目的基因片段的大肠杆菌送上海 生工测序。测序结果表明该基因的ORF为1398bp ;5'端非编码区为192bp ;3'端非编码区 为490bp，编码465个氨基酸。将测序结果与无隔藻中aureochromel基因的序列进行相似 性比较，发现微拟球藻中的aureochromel基因编码的氨基酸序列与无隔藻中相应基因编 码的氨基酸序列有59 %的同源性。将这个蛋白序列进行BLAST分析，显示该蛋白的241-300 位氨基酸为一个bZIP转录因子结构域；341-444位氨基酸为一个可以感受蓝光的LOV结构 域。以上分析说明该基因为微拟球藻中的一类新的可以感受蓝光的bZIP类转录因子，命名 为 NgAUREOl。 2、构建了 NgA UREOl基因的酵母表达载体pYES2-NgAURE01 设计一对带有HindIII和SacI限制性酶切位点的引物（P1，P2)以微拟球藻cDNA 为模板扩增NgAUREOl基因，并将扩增产物纯化后连接到pMD19-T载体上，导入大肠杆菌中 进行繁殖。提取质粒利用HindlII和SacI限制性酶对pMD19-T和pYES2同时进行双酶切， 分别获取小片段和大片段，利用T4连接酶进行连接后转化大肠杆菌并进行PCR和酶切鉴定 后得到重组质粒pYES2-NgAURE01。 3、证明了该基因可以促进脂肪酸积累的新功能 分别将构建好的重组质粒pYES2-NgAURE01和空质粒PYES2,分别通过电击的方法 转化进入酿酒酵母细胞内。利用2%的半乳糖进行诱导，测定两者的油脂含量。实验表明， 转pYES2-NgAURE01质粒的酵母细胞的油脂含量比转空质粒pYES2的酵母细胞的油脂含量 要高。这表明了，NgAUREOl是一类可以促进细胞积累油脂的转录因子。本专利技术首次证明了 微拟球藻aureochromel基因具有积累油脂的功能，提示本专利技术的基因 NgAUREOl可以用于 微藻乃至其他各类生物质能源材料的遗传改造，从而获得高油脂含量的生物原料。对于开 发生物质能源具有重要的理论意义和实际意义。 4、证明了 NgAUREOl基因可以蓝光作为开关进行脂肪酸代谢的调节 将两组重组酵母先置于黑暗条件下诱导培养两天，然后给其中一组进行48小时 的蓝光刺激，另一组则保持在黑暗条件下。利用尼罗红染色法测定这两组酵母的油脂含量。 结果表明，在蓝光刺激后酵母的油脂含量明显降低，而再转移到黑暗条件下时，酵母的油脂 含量又会有所上升。提示本专利技术的基因 NgAUREOl可以在蓝光的控制下调节脂肪酸含量。 四、附图简要说明： 图1是表示酵母表达载体pYES2-NgAURE01构建流程的图。 图2是重组酵母的PCR鉴定。 图中扩增条带大小约为1400bp，电泳带从左到右分别编号为1、2、3、M。1-3为阳 性克隆，M为分子标记Marker。 图3是酿酒酵母在不同时间段的尼罗红荧光值。 横坐标为时间，纵坐标为荧光值。转PYES2的酿酒酵母表示为▲;转 pYES2-NgAURE01的酿酒酵母表示为·。 图4是转PYES2与转pYES2-NgAURE01的酿酒酵母的油脂含量。 纵坐标为油脂占酵母干重的质量百分比。 图5是转pYES2_NgAURE01的酿酒酵母在蓝光与黑暗条件下的尼罗红荧光值。 横坐标为时间，纵坐标为荧光值。▲表示在诱导第二天后进行48小时的蓝光刺 激，再转入黑暗中；表示在黑暗条件下诱导7天的油脂含量。 五、【具体实施方式】： 所有实施例中的微生物培养和DNA操作均参考《分子克隆实验指南》（黄培堂等 译，科学出版社，北京（2002))和《精编分子生物学指南》（颜子颖等译，科学出版社，北京 (1998))。分子操作中的工具酶如限制性内切酶均购自Takara公司。 实施例INgAUREOl基因的克隆 从本实验室所建立的本文档来自技高网...
【技术保护点】
从微拟球藻中克隆的编码区为1398bp的受蓝光诱导的转录因子基因NgAUREO1，该基因的特征在于：该基因编码一条由465个氨基酸组成的蛋白，该蛋白由一个N端的碱性亮氨酸拉链(bZIP)和一个C端的LOV感光结构域组成。
【技术特征摘要】
1. 从微拟球藻中克隆的编码区为1398bp的受蓝光诱导的转录因子基因 NgAUREOl，该 基因的特征在于：该基因编码一条由465个氨基酸组成的蛋白，该蛋白由一个N端的碱性亮 氨酸拉链（bZIP)和一个C端的L0V感光结构域组成。2. 根据权利要求1所述的基因，该基因所编码的氨基酸序列与无隔藻中的 aureochromel基因所编码的氨基酸序列具有59%的同源性，无隔藻中该基因的GenBank登 陆号 gi 1158853253 | dbj | BAF91488. 1。3. 根据权利要求1所述的基因，该基因可用于构建成适合在酿酒酵母中表达NgAUR...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑明刚，黄一江，王玲，郑立，李妍，仝颜丽，赵燕燕，王春，周晓丽，
申请(专利权)人：郑明刚，黄一江，王玲，
类型：发明
国别省市：山东;37
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