一种肽的制备方法及其在制备药物和饲料添加剂中的应用技术

本发明专利技术“一种肽的制备方法及其在制备药物和饲料添加剂中的应用”，涉及生物制药技术。本发明专利技术的肽具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列，经细胞试验验证，其具有对乙肝病毒的明显抑制作用，经动物试验验证，其还有全面改善动物健康状态的作用；本发明专利技术还提供了基因工程方法制备该多肽的方案，能制备得到克级以上的肽产物。本发明专利技术的肽在抗病毒、全面改善动物健康状态等方面的作用，使其能够作为制备人和动物都可以使用的治疗药物和保健产品的主要成分，应用于治疗药物、健康产品和饲料添加剂中。

【技术实现步骤摘要】
一种肽的制备方法及其在制备药物和饲料添加剂中的应用 第一部分：
本专利技术涉及生物制药领域，特别是涉及一种肽(Mytilin B)及其在制备治疗药物、 健康产品和饲料添加剂中的应用、制备方法。 第二部分：
技术介绍
防御素是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，天然免疫物 质，分子量在3000?7000左右，由20?60个氨基酸残基组成，多个二硫键。这类活性多 肽多数具有强碱性、热稳定性、以及广谱抗菌等特点。天然的防御素分布在从植物、低等动 物到哺乳动物等几乎所有的生物类群中，是生物自身防御体系的重要组成部分。 多数防御素能有效杀灭革兰阴性细菌和革兰阳性细菌。在体外浓度为10? IOOmg / L的防御素即对多种细菌具有杀伤作用，而防御素在中性粒细胞中的浓度为g / L 级，远远超过上述数值，这表明在体内防御素可能具有更强的杀菌活性，目前研究发现防御 素对革兰阳性细菌的杀伤能力明显要强于革兰阴性细菌。在体外，HBD-2对大肠杆菌的半数 致死量（LD50)为0. 46nmol / ml，最小抑菌浓度（MIC)为15yg / ml，而对绿脓杆菌、金黄 色葡萄球菌的MIC为62yg / mi。体外实验证明大多数防御素的MIC范围为0. 5-ΙΟμπιοΙ / L〇 防御素还能杀灭一些被膜病毒,如HIV、疱疹病毒、水泡型口炎病毒，但对无衣壳病 毒却无效。Θ-防御素还具有抗滤过性病原体和抗毒素作用。防御素主要通过与病毒外壳 蛋白结合从而导致病毒丧失生物活性，这一特殊作用机理也使得微生物不易对其产生抵抗 性。防御素可直接抑制病毒，对病毒的抑制程度依赖于防御素浓度以及分子内二硫键的紧 密程度，其抗病毒功效同样受时间、PH值、离子强度和温度等因素的影响，在中性及低离子 强度条件下，防御素具有较强的抗病毒活性。 防御素不仅可以直接抵抗病原微生物，而且还具有免疫调节作用。防御素通过细 胞信号传递的作用，增强非特异性免疫细胞，尤其是巨噬细胞的活性和趋化性。防御素还可 以促进机体T细胞的趋化和增殖，增强机体免疫应答能力，调节特异性免疫，增强生物机体 主动防御功能。防御素能够作为一种效应分子激活巨噬细胞、DC、气管上皮细胞等细胞表 面受体从而启动获得性免疫系统，并将先天性免疫和获得性免疫有机连接。现已证明一些 α -防御素 、β -防御素对T细胞、单核细胞以及未成熟的DC具有趋化活性，可诱导单核细 胞和上皮细胞产生细胞因子。人、鼠、猪、兔的中性粒细胞防御素可以诱导肥大细胞脱颗粒 并释放组胺。β-防御素还能通过与人趋化因子受体6 (CCR6)结合，从而吸引不成熟的树突 状细胞（DC)和记忆T细胞（Tm)至炎症部位，激活细胞免疫和体液免疫。此外，防御素还可 以直接促进感染部位中性粒细胞的补充和积聚。 抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生态平衡，药物残留也影响了畜产 品的品质和人类健康，而来源于贝类、哺乳动物的防御素相对分子质量较小，热稳定性和水 溶性均较奸，可以在肠道内吸收。由于防御素属于多肽成分，在体内容易被蛋白酶降解为 氨基酸，动物采食后在体内一般无残留。利用基因工程方法生产环保型防御素饲料添加剂 或通过日粮添加，都可有效提高免疫、防止疾病和促进生长，如减少死胎、木乃伊及残疾；提 高初生重及仔猪出生均匀度；提高仔猪断奶重、断奶成活率，降低哺乳期仔猪发病率；降低 哺乳母猪发病率，减少母、仔猪各种应激；改善母猪亚健康和繁殖障碍，延长母猪使用年限； 提高保育猪成活率，降低发病率；提高保育猪日增重、降低料肉比；改善免疫抑制，提高免 疫应答能力，抗体水平更整齐。 源自地中海贻贝的防御素 Mytilin B氨基酸序列如Seq ID No. 3所示，其由34个 氨基酸残基组成，4个二硫键，复合螺旋和β结构。Mytilin B防御素具有广谱活性，能抑 制革兰氏阳性和阴性菌，同时具有抗病毒的活性。Mytilin B防御素利用N端所带的正电荷 与原核细胞的细胞的细胞膜磷脂双分子层密集的负电荷静电相吸，C端柔性的插入疏水区， 在两亲性α -螺旋作用下，在原核细胞膜上形成4nm的离子通道，离子通道的形成改变了细 胞膜内外的渗透压，细胞膜内物质大量外渗，致细菌细胞死亡，起到杀菌作用。Mytilin B防 御素的抗病毒机理是与病毒的衣壳特异性结合，从而抑制病毒的复制。 法国科学家在贻贝的防御素 Mytilin研究方面做了大量的工作，天然的贻贝防 御素有 MytiIin A (Seq ID No. 3)，Mytilin B (Seq ID No. 1)，Mytilin C (Seq ID No. 4)， Mytilin D(Seq ID No. 5)和 Mytilin G(Seq ID No. 6)等。由于防御素 Mytilin 分子小，分 离提纯存在一定的困难，且天然资源有限，很难产业化；因为防御素的二硫键和多肽空间结 构决定了其基本的特性，化学合成不可能得到具有良好活性的产品，多方研究表明，化学合 成的活性产品只有天然产物的百分之一或更低；只有基因工程途径才能获得具有良好活性 的防御素，由于高浓度Mytilin防御素多肽可杀灭绝大多数宿主细胞，同时在分泌表达过 程中，防御素容易被宿主菌的酶系统所降解，从而产生两败俱伤的情形而无法真正获得足 量的表达产物。所以，目前还没有Mytilin防御素多肽的工程菌表达产业化生产技术，也未 见到准确表达和获得足量的该多肽以供试验用的报道，更未见到其在乙肝治疗、免疫药物、 饲料添加剂等方面的应用报道。 第三部分：
技术实现思路
本专利技术根据上述领域的空白和需求，提供一种源自地中海贻贝防御素的的生物工 程制备方法及其在制备治疗药物、健康产品和饲料添加剂中的应用。 一种肽，其特征在于具有Seq ID No. 1所示的氨基酸序列。 编码上述肽的基因。 所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。 含有上述基因的表达载体。 所述表达载体的骨架载体为pKLACl。 上述肽的制备方法，其特征在于将上述表达载体转入到酵母细胞中，发酵培养。 所述酵母细胞为蛋白酶缺陷型K. Iactis YCT389, YCT390、YCT569与YCT598。 上述肽在制备治疗药物、健康产品和饲料添加剂中的应用、制备方法。 所述药物和产品为口服制剂。 本专利技术根据源自地中海贻贝的防御素 Mytilin B，由34个氨基酸组成，分子量为 3981. 7Da，等电点9. 58,疏水比率41%，净电荷+9。由于绝大多数多肽，包括Mytilin B在 酵母分泌表达异源蛋白时候会被降解，其主要原因是由于分泌途径中天冬氨酰蛋白酶作用 引起的，在许多情况下，仅天冬氨酰蛋白酶就可导致大多数蛋白被破坏性地降解。K. Iactis YCT389、YCT390、YCT569与YCT598菌株均为特异性分泌途径天冬氨酰蛋白酶基因无选择标 记删除型，我们选择了其作为Mytilin B的宿主菌，获得了经济和稳定的表达，实现产业化 制造。发酵过程我们全程采用了液质联用监测分泌表达出的多肽的降解情况。 本专利技术提供了 Mytilin B肽的制备方法，本专利技术将构建得到的表达载体转入到酵 母表达系统中，使其表达Mytilin B肽，通过后续的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种贻贝肽，其特征在于具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1. 一种贻贝肽，其特征在于具有Seq ID No. 1所示的氨基酸序列。2. 编码权利要求1所述的肽的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。4. 含有权利要求3所述的基因的表达载体。5. 根据权利要求4所述的表达载体，其骨架载体为pKLACl或pKLAC2。 6?如 Seq ID No. 1、Seq IDNo. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6 所示的氨 基酸序列多肽采用本专利所述酵母菌K. lactis YCT389、YCT390、YCT569与YCT598制备，及 类似酵母菌K. lactis YCT284、YCT799、酿酒酵母、面包酵母、乳酸克鲁维酵母和啤酒酵母制 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓立，丁杰，刘勇，邓韵蕾，陆洋，陈尚卫，
申请(专利权)人：邓立，
类型：发明
国别省市：江苏;32