一种结核分枝杆菌的耐药新基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种结核分枝杆菌耐药新基因及其应用，所述基因编码如下任意一种蛋白：i）所述蛋白序列包含氨基酸和/或核苷酸序列表中的SEQ ID No.2序列；ii）序列i）经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白序列、并且具有与序列i）相同的功能。药敏检测发现，该基因能够使得细菌对多种抗结核药物产生耐药性。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌的耐药新基因及其应用
本专利技术涉及一种基因片段，尤其涉及一种结核分枝杆菌的耐药新基因。
技术介绍
结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，其中，结核分枝杆菌（M.tuberculosis，俗称结核分枝杆菌），是引起结核病的病原菌。结核分枝杆菌可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一。虽然，随着生活水平提高和卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，使得结核病的发病率和死亡率大为降低。但是耐药及耐多药结核分枝杆菌的出现使得结核病的形势日益严峻，近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行，我国第四次结核病流行病学抽样调查显示，我国结核病总耐药率以接近30%。结核分枝杆菌的耐药可由自发突变产生（原发性耐药）或由用药不当经突变选择产生（继发性耐药），但多耐的产生可能主要是由于后者。随着耐药性研究的深入，人们发现结核分枝杆菌耐药性的产生大多是由于特定基因位点发生突变所致，目前已发现的耐药基因包括KatG、inhA、kasA、ndh、oxyR-ahpC基因间隔区、rpoB、embB、embC、embA、pncA、rrs、gyrA和gyrB基因等，例如结核分枝杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因KatG基因的缺失和突变有关，并与inhA基因的突变也有相关性；耐乙胺丁醇的产生和EMB基因的突变有关；耐链霉素的产生则是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA编码的rrs的缺失和突变所致；耐利福平的产生与其核心区域rpoB基因突变有关。因此，对结核分枝杆菌耐药基因及其编码蛋白的研究有助于进一步加强对结核分枝杆菌的治疗和预防。尽管针对单一抗结核药物的耐药基因已多有揭示，但已知的耐药基因仅能解释部分临床菌株的耐药情况，并不能解释全部的耐药，尤其是临床菌株的耐多药情况。目前耐药结核分枝杆菌、尤其是耐多药结核分枝杆菌的传播和蔓延依然是结核病控制的难题，因此，及时发现细菌中出现的耐药新基因，尤其是那些与细菌的耐多药产生相关的基因，对新的抗结核药物的开发及结核病的防治具有重要的意义。
技术实现思路
基于以上背景，本专利技术提供了一种新的结核分枝杆菌的耐药新基因，以及由所述基因编码的蛋白，以及它们的应用。本专利技术第一个方面是提供一种结核分枝杆菌的耐药新基因，所述基因编码如下任意一种蛋白序列：i）所述蛋白序列包含氨基酸和/或核苷酸序列表中的SEQIDNo.2序列；ii）序列i）经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白序列、并且能够使结核分枝杆菌产生耐药的蛋白序列。在本专利技术第一个方面所述的耐药新基因中，所述蛋白序列优选为序列i）。在本专利技术第一个方面所述的耐药新基因中，所述基因的编码区核苷酸序列包含氨基酸和/或核苷酸序列表中的SEQIDNo.1序列。本专利技术第二个方面是提供一种蛋白序列，所述蛋白序列选自如下任意一种蛋白序列：i）所述蛋白序列包含氨基酸和/或核苷酸序列表中的SEQIDNo.2序列；ii）序列i）经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白序列、并且具有与序列i）相同的功能。在本专利技术第二个方面所述的耐药新基因中，所述蛋白序列优选为序列i）。本专利技术第三个方面是提供一种重组载体，所述载体含有本专利技术第一个方面所述的任意一种耐药新基因。本专利技术第四个方面是提供一种转化体，所述转化体含有本专利技术第一个方面所述的任意一种耐药新基因，或者本专利技术第三个方面所述的重组载体。优选地，所述转化体为耐药菌株。本专利技术第五个方面是提供一种制备上述转化体的方法，步骤包括：将本专利技术第一个方面所述的耐药新基因导入到宿主中。本专利技术第六个方面是提供一种针对上述任意蛋白序列制备的工程抗体，其中，所述工程抗体能够免疫检测所述结核分枝杆菌、和/或免疫治疗所述结核分枝杆菌导致的感染疾病。本专利技术第七个方面是提供一种上述任意一种转化体在制备预防结核分枝杆菌的免疫制剂中的应用。本领域技术人员应当理解的是，本专利技术所述免疫制剂可以是由细菌制成的菌苗，以及由病毒、立克次体、螺旋体制成的为疫苗等。本专利技术从上海市肺科医院的结核科病人培养阳性、涂片阳性的痰标本中分离出3株对利福平、乙胺丁醇、异烟肼、链霉素等4种一线抗结核药物同时耐药的结核分枝杆菌，通过PCR扩增测序得到一种耐药基因的编码区核苷酸序列（SEQIDNO.1）及其编码的响应蛋白序列（SEQIDNO.2），将该基因转化到不含该基因的野生型耻垢分枝杆菌（ATCC19420）中，药敏检测发现，该基因能够使得耻垢分枝杆菌对多种抗结核药物产生耐药性。本专利技术所述的耐药新基因编码蛋白，能够实现对利福平、乙胺丁醇、异烟肼、链霉素等一线抗结核药物的抗药性，因此，针对该蛋白制备工程抗体，能够起到免疫检测所述结核分枝杆菌、和/或免疫治疗所述结核分枝杆菌导致的感染疾病的目的。此外，在制备抗结核药物过程中，通过所述编码蛋白可以更为方便的验证所制备的药物的抗结核性能。附图说明图1为质粒转导实验和原核表达实验验证新基因的功能流程示意图。具体实施方式从上海市肺科医院结核科病人培养阳性、涂片阳性的痰标本中分离出3株对4个一线抗结核药物利福平、乙胺丁醇、异烟肼、链霉素同时耐药的结核分枝杆菌。将上述获得的菌株在米氏7H9液体培养基中培养2周，收集菌体，获得基因组DNA作为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物进行测序，得到该耐药基因的编码区核苷酸序列（SEQIDNO.1）及编码的相应的蛋白质序列（SEQIDNO.2）。通过序列同源性比对，发现该序列是由于结核分枝杆菌基因组DNA中RD105区的缺失产生的融合基因MFG71/74，该基因由结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的79486-795567区的核苷酸序列和83034-83983区的核苷酸序列组成；79486-795567区中含有9bp的重复序列（GGTGGACCC），在H37Rv菌株中，所述9bp重复序列的重复数为5，在新融合基因中其重复数为9（对应的氨基酸为9个重复的VDP），将该基因命名为MFG71/74-9。为了证实受体菌获得的抗性来源于MFG71/74-9基因，本专利技术将MFG71/74-9基因重组到PVV16载体中，并将其转化入野生型的耻垢分枝杆菌（ATCC19420，该菌不含有MFG71/74基因的同源基因）中，通过含有潮霉素的米氏7H10固体平板筛选阳性克隆（含有PVV16-MFG71/74-9重组质粒的细菌），将阳性克隆做药敏试验，结果显示MFG71/74-9基因可以使耻垢分枝杆菌具有对以下药物耐药：乙胺丁醇、链霉素、异烟肼利福平、阿米卡星、卷曲霉素、利奈唑胺、利福布汀、头孢西丁钠、妥布霉素。实施例1一、材料和方法1.Axgen质粒小抽试剂盒，TakaRa公司的PMD18-T载体试剂盒、北京天根公司的DNA凝胶回收试剂盒，TakaRa公司的高保真酶，二、方法2.1含有MFG71/74-9基因的结核分枝杆菌的分离及抗结核一线药物的药敏检测将来自上海市肺科医院结核科病人的痰标本，接入等体积的4wt%的NaOH溶液，涡旋振荡15-20min后，加入20-40mL0.067mol/L的PBS混匀。3000g离心30min，去上清，沉淀物加入0.5mLPBS混匀；取0.1ml的处理标本，无菌操本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌的耐药新基因，其特征在于，所述基因编码如下任意一种蛋白序列：i）所述蛋白序列包含氨基酸和/或核苷酸序列表中的SEQ ID No.2序列；ii）序列i）经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白序列、并且能够使结核分枝杆菌产生耐药的蛋白序列。

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌的MFG71/74-9基因作为耐药基因的应用，其特征在于，所述MFG71/74-9基因编码如氨基酸和/或核苷酸序列表中的SEQIDNo.2所示序列；其中，所述耐药是指对以下药物耐药：乙胺丁醇、链霉素、异...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦莲花，戈宝学，胡忠义，王洁，陆俊梅，
申请(专利权)人：上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：上海;31