检测哺乳动物基因组三核苷酸重复序列的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及检测哺乳动物基因组三核苷酸重复序列的方法及其应用。具体而言，本发明专利技术涉及使用C2H2锌指蛋白检测哺乳动物基因组的三核苷酸重复序列。本发明专利技术还涉及具体的C2H2锌指蛋白、其编码序列、含有其编码序列的多核苷酸构建物、以及细胞，以及它们的用途。

【技术实现步骤摘要】
检测晡乳动物基因组三核苷酸重复序列的方法及其应用
本专利技术涉及核苷酸检测领域，具体涉及检测哺乳动物基因组三核苷酸重复序列的 方法及其应用。
技术介绍
三核苷酸重复（trinucleotide repeat, TNR)，一种在哺乳动物中普遍存在的三核 苷酸序列的扩增，其在蛋白或RNA水平上通过获得或失去性突变而影响到正常基因功能， 引发与神经-肌肉系统相关的退行性疾病。三核苷酸重复的这种不稳定性在组织及其传代 过程中显现出动态的变化，并且较长的重复序列与较短的相比，更有可能发生重复数增加 的突变。同时由于重复序列的长度与疾病的严重性及病人发病的年龄相关，因此大部分三 核苷酸重复引起的疾病都呈现出遗传早现的特征。随着发育、表观、增殖甚至环境等因素的 变化，三核苷酸重复的不稳定性在个体、组织以及个体不同的年龄阶段之间都表现出复杂 的样式。 在人类基因中，三核苷酸重复的扩增引发了一系列的常染色体显性或隐性的疾病 紊乱，比如多聚谷氨酰胺疾病（亨廷顿舞蹈症，各种类型的脊髓小脑性共济失调，脊髓延髓 肌肉萎缩症等)，Friedreich共济失调，脆性X综合症，营养不良性肌强直等。现在有三十 种左右的已知疾病与三核苷酸重复相关，其中多聚谷氨酰胺疾病（亨廷顿舞蹈症，各种类型 的脊髓小脑性共济失调，脊髓延髓肌肉萎缩症等)与CAG重复相关；Friedreich共济失调与 GAA重复相关；脆性X综合症与CGG重复相关；营养不良性肌强直与CTG重复相关；等等。 其中，各个疾病的确切发生发展都依赖于对应重复序列在基因中的定位，还有对应致病基 因的时空表达方式及其功能。每个重复序列扩增引发相关的疾病都显现出确切的重复片段 阈值，也就是当重复片段数目超过该确切的阈值时，可能会在蛋白或RNA水平上发生积累 改变，从而引发基因功能的致病改变。 因此，三核苷酸具体重复数目对于相应基因受累疾病的预测、及发病病程、病因等 均存在重要的提示作用，检测三核苷酸重复数目对于研究发病机制尤为必要。现在主要的 方法通过设计引物覆盖已知具体基因序列，再进行PCR反应扩增出对应基因的重复片段， 通过测序手段进行确认。然而对于多基因突变相关的神经系统疾病，包括前面提及的单基 因突变疾病，其中三核苷酸重复在多基因水平上所扮演的角色进行研究，则需要对研究手 段需要更多的考虑。目前的研究手段中，即使全基因关联研究（GWAS)对于这类多基因相关 的疾病中的各个基因，尤其是三核苷酸重复所在基因所起的作用也无法进行具体分析，因 此有必要开发出全基因组角度的对三核苷酸重复序列进行系统研究的方法。 在人类基因组中，锌指蛋白是最为常见的DNA结合基序，占到2-3%的百分 比（Initial sequencing and analysis of the human genome，'， International Human Genome Sequencing Consortium, Nature2001, 409,860 - 921)。锋指蛋白 涉及到一系列的生物功能，包括发育、分化、抑制肿瘤等等（S. Iuchi和N.Kuldell， Zinc Finger Proteins:From atomic contact to cellular function, Landes Biosciences, Georgetown, TX, 2004)。锌指蛋白结构域由二十至三十个氨基酸残基组成，它 们形成由锌离子与指环结构上的Cys和His残基结合形成稳定的二级结构。根据与锌离子 配位的氨基酸种类和数目，可以将锌指蛋白分成多个种类。其中，经典的C 2H2锌指蛋白最为 常见，在锌离子协助下折叠形成β β α二级结构，而α螺旋上的-1，3和6位氨基酸残基 参与锌指蛋白特异地结合靶点DNA序列。并且锌指蛋白大部分由多个C2H 2锌指蛋白通过串 联连接的方式构成。由于C2H2类锌指结构域的独立结构及其特异分子识别特性，被逐渐尝 试用来设计新锌指蛋白，使其具有新DNA结合能力，通过与不同作用结构域的融合，可能用 于各种生物医学应用中。 本专利技术利用C2H2锌指蛋白的可组装及改造后特异识别DNA的特征，对三核苷酸 重复序列进行特异性结合，利用生物化学的方法，将三核苷酸重复序列体外富集出，经过高 通量测序手段和后续生物信息学分析，从全基因组角度将三核苷酸重复所在的基因位点找 出，以寻找未知的参与疾病发生的关键基因，以解决现在仍无法全面了解的症结所在。
技术实现思路
本专利技术首先通过凝胶阻滞实验验证了本专利技术人开发的锌指蛋白和靶标DNA间的 特异性相互作用；同时开发出了新的ZIP-seq技术，在体外运用锌指蛋白将基因组DNA中富 含特异性重复序列的核酸片段富集出，并且通过高通量测序和生物信息学方法将特定的三 核苷酸重复在全基因组中的分布定位出。临床样本结合，可将本专利技术的工具用来检测临床 病例中的三核苷酸重复的分布，从而为临床上已知表型，却对发病机制一无所知的分子机 制展开新的视野，并且对可能发现的新基因进行进一步的功能研究。 因此，本专利技术提供一种基因组特殊序列测序或检测基因组特殊序列的方法，该方 法包括： 混合特殊序列结合物和含DNA的样品，和 对富集的DNA或DNA片段进行测序分析。 在一具体实施例中，所述方法包括： (1)在适合所述特殊序列结合物与所述DNA结合的条件下孵育所述特殊序列结合 物与DNA ; (2)分离出结合的特殊序列结合物-DNA ; (3)从步骤（2)获得的特殊序列结合物-DNA分离纯化得到DNA ;和 (4)对步骤（3)分离纯化得到的DNA进行测序。 在一具体实施例中，所述方法还包括，将测序信息与基因组信息匹配，获得基因组 特殊序列信息。 在一具体实施例中，所述特殊序列为三核苷酸重复序列。 在一具体实施例中，所述特殊序列结合物包括锌指蛋白或转录激活子样效应因 子。 在一具体实施例中，所述锌指蛋白是C2H2型锌指蛋白。 在一具体实施例中，所述三核苷酸重复序列选自（GCT) n、（CTG) n、（TGC) n、(AGC) η、 (GCA) η、（CAG) η、（GGC) η、（GCG) η、（CGG) η、（GCC) η、（CCG) η、（CGC) η、（GAA) η、（AAG) η、（AGA) η、（TTC) η、（TCT) η和（CTT) η，其中，η为大于等于3的整数。 在一具体实施例中，η彡100。 在一具体实施例中，所述锌指蛋白是C2H2型锌指蛋白。 在一具体实施例中，所述锌指蛋白含有SEQ ID NO :1、2或3所示的氨基酸序列。 本专利技术还提供一种检测哺乳动物基因组三核苷酸重复序列的方法，所述方法包 括： 混合锋指蛋白和含DNA的样品，和 对富集的DNA或DNA片段进行测序分析， 从而检测哺乳动物基因组中的三核苷酸重复序列。 在一具体实施例中，所述三核苷酸重复序列选自（GCT) n、（CTG) n、（TGC) n、(AGC) η、 (GCA) η、（CAG) η、（GGC) η、（GCG) η、（CGG) η、（GCC) η、（本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因组特殊序列测序或检测基因组特殊序列的方法，该方法包括：混合特殊序列结合物和含DNA的样品，和对富集的DNA或DNA片段进行测序分析。

【技术特征摘要】
1. 一种基因组特殊序列测序或检测基因组特殊序列的方法，该方法包括： 混合特殊序列结合物和含DNA的样品，和 对富集的DNA或DNA片段进行测序分析。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 在适合所述特殊序列结合物与所述DNA结合的条件下孵育所述特殊序列结合物与 DNA ； (2) 分离出结合的特殊序列结合物-DNA ; (3) 从步骤（2)获得的特殊序列结合物-DNA分离纯化得到DNA ;和 (4) 对步骤（3)分离纯化得到的DNA进行测序。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法还包括，将测序信息与基因组信 息匹配，获得基因组特殊序列的位置信息。4. 如权利要求1 一 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述特殊序列为三核苷酸重复 序列。5. 如权利要求1 一 4中任一项所述的方法，其特征在于，所述特殊序列结合物包括锌指 蛋白或转录激活子样效应因子。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述锌指蛋白是C2H2型锌指蛋白。7. -种检测哺乳动物基因组三核苷酸重复序列的方法，所述方法包括： 混合锌指蛋白和含DNA的样品，和对富集的DNA或DNA片段进行测序分析， 从而检测哺乳动物基因组中的三核苷酸重复序列。8. 如权利要求1 一 7中任一项所述的方法，其特征在于，所述三核苷酸重复序列选自 (GCT)n、（CTG)n、（TGC)n、（AGC)n、（GCA)n、（CAG)n、（GGC)n、（GCG)n、（CGG)n、（GCC)n、（CCG)9. 如权利要求5 - 8中任一项所述的方法，其特征在于，所述锌指蛋白是C2H2型锌指 蛋白。10. 如权利要求5 - 9中任一项所述的方法，其特征在于，所述锌指蛋白包括SEQ ID NO :1、2或3所示的氨基酸序列。11. 一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自： (l)SEQ ID N0:l、2或3所示的氨基酸序列；或 (2 )在SEQ ID NO : 1、2或3所示的氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡荣贵，徐星星，傅兴，陈侃，于涛，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31