本发明专利技术涉及一种生产柚苷酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明专利技术的生产柚苷酶的方法，是将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；再在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；离心分离液体发酵液，取上清液；上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、SephacrylS-200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。本发明专利技术制备柚苷酶的方法，具有产酶水平高、发酵时间短、易于控制生长条件、易于分离、纯度高、操作简单、条件温和等诸多优点，完全适合工业化生产的应用。以粉碎过60目的橘子皮作为柚苷酶发酵底物，充分利用了生活垃圾废弃物，节约成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产柚苷酶的方法，属于微生物发酵
技术背景 柚苷酶是一种重要的用于果汁里苦味物质水解的酶，是由α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）与β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC3.2.1.21）组成的一种糖苷水解复合酶系，同时具有 α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶两种酶的活性，柚苷酶可以作用于有苦味的柚皮苷并将其水解产生黄酮类物质，过程是柚皮苷先在α-L-鼠李糖苷酶作用下生成鼠李糖及普鲁宁（Prunin，又译作樱桃苷），普鲁宁的苦味约为柚皮苷的三分之一，因此苦味有所减轻，然后普鲁宁可在β-D-葡萄糖苷酶的作用下被分解为无苦味的柚皮黄酮物质（主要为柚皮苷）。柚苷酶的微生物来源方面主要集中在霉菌（黑曲霉和青霉等），细菌产柚苷酶的相关报道较少。 我国是柑橘生产大国，但是目前在柑橘果汁的加工行业主要问题就是果皮的深加工利用问题。在被当作垃圾大量处理掉到的柑橘皮含有丰富的柚皮黄酮 ( 主要为柚皮苷)， 果胶，膳食纤维等，如能将其充分利用，不仅能够减轻环境压力，还可以造福于人类。现代药理学研究发现，柚皮黄酮具有多种生理活性：可调节毛细血管的脆性与渗透性，保护心脏，有抗溃疡、解毒、利尿、抗菌、消炎清热等功效, 也是一种高效的天然抗氧化剂, 是一种天然的保健产品。 因此柚皮的深加工将大幅提高果农的收入，提高柚子的附加值等。 虽然对柚苷酶的研究越来越深入，但目前仅有少数柚苷酶的生产实现了工业化，目前限制柚苷酶的大规模工业化应用方面存在两个问题：第一个主要问题是我国缺乏适合工业化生产的高产酶菌株，这就极大限制了应用，高产柚苷酶菌株的培育困难之处在于如何在大量的诱变后代中将优秀突变株高效率的选出 ，到目前为止尚无较好的办法，菌株的选育进展缓慢，发展出新的高效的筛选方法很有必要，因此对高产菌株的培育是目前的当务之急。第二个问题是柚苷酶的固定化技术在国内还存在着很多的缺陷，在固定化中使用的试剂或载体存在成本偏高、固定化效率低下、稳定性较差、连续操作使用的设备较复杂等，这就需要我们国家进一步开发出更简便同时更适用的固定化方法，柚苷酶应用于柑桔及其他制品的脱苦与加工国外已有相关报道，但在我国柚苷酶并没有大规模的在生产中应用，主要原因是国内尚无规模制备的商品柚苷酶出售，今后我们应加强关于选育高产柚苷酶菌株的方法，并制备出低成本的柚苷酶纯酶，具有重要的实际意义。 与霉菌（黑曲霉和青霉等）液体发酵产柚苷酶相比，细菌液体发酵生产柚苷酶具有生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点，近几年得到研究者更多的关注。但是，细菌生产的柚苷酶活性和霉菌相比，还具有一定的差距；目前所报道细菌发酵产酶水平不超过1000 U单位每毫升发酵液；细菌发酵产柚苷酶最适作用温度偏中性环境可能限制其在酸性环境中的部分应用。
技术实现思路
本专利技术通过创造性劳动，培养出了一种能够产柚苷酶的解淀粉芽孢杆菌；进而提供了一种用解淀粉芽孢杆菌生产柚苷酶的方法。本专利技术的解淀粉芽孢杆菌产的柚苷酶，分子量为32.5 kDa，最适宜作用温度、pH分别为45℃、7.5。本专利技术的解淀粉芽孢杆菌产的柚苷酶与本专利技术之前的由细菌和霉菌生产的柚苷酶相比，存在以下特殊之处：从解淀粉芽孢杆菌11568中产柚苷酶的部分酶学性质（最适pH和pH值稳定性、最适温度和温度稳定性）等研究，表明其在产业化应用前景的果汁脱苦等领域有极大应用前景，在提高葡萄酒的风味、改善饮料的香气成分和生产食品添加剂中也起到重要作用，对柚苷酶的分离纯化及性质的研究为制备出更好的在工业上应用的商品酶提供重要依据。 本专利技术的技术方案 本专利技术提供了一种新的生产柚苷酶的方法。一种生产柚苷酶的方法，包括以下步骤： （1）将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；（3）离心分离液体发酵液，取上清液；（4）上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。所述保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568，即为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）11568，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；其保藏日期为2014年11月4日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。 上述步骤（1）中，所述斜面培养基，每1L中含有以下成分：MgSO4 0.5g、KH2PO4 1.5g、CaCl2 0.1g、（NH4）2SO4 1.5g、KCl 0.5g、KNO3 1.5g、酵母膏 2g、桔皮粉15g、琼脂 20g，pH为6.0，1×105 Pa 灭菌20 min。 上述步骤（2）中，所述种子培养基，每1L中含有以下成分： 麦芽糖15.1g、胰蛋白胨 10g、（NH4）2HPO4 20g、NaCl 10g、酵母提取物 5g，pH为7.51；或者，柚皮苷10g、胰蛋白胨10g、（NH4）2HPO4 20g、NaCl 10g、酵母提取物 5g，pH为7.51；或者，MgSO4 0.5g、 KH2PO4 1.5g、 CaCl2 0.1g、（NH4）2SO4 1.5g、 KCl 0.5g、KNO3 1.5g、酵母膏 2、桔皮粉7.5g，pH 为6.0。上述步骤（3）中，液体发酵液经超声波破壁后离心分离；超声波频率为25-30Hz，超声时间为10min，超声2.5s，停2.5s；离心的转速为5000－6000rpm，离心时间为10－15min。 上述步骤（4）中，在离子交换层析之后、凝胶过滤层析之前，用0.01-0.5mol/L NaCl进行洗脱。 所述步骤（4）中硫酸铵分级沉淀的具体步骤为：向上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为0.01％－40％，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为40％-80%为止，过滤得到含柚苷酶沉淀。所述的质量体积浓度是指：每mL上清液中含有硫酸铵的质量（g）。 所述步骤（4）中离子交换层析，是指Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析；其具体步骤为：首先利用缓冲体系为20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱料；基线平衡后加入目的蛋白液体量500微升，吸附时间为30min；吸附过后用0.01-0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速设置为1mL/min，检测每管洗脱液中柚苷酶活力和蛋白质含量。其中，梯度洗脱的具体操作为：设置洗脱程序用0.01-0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速设置为1mL/min，收集液体。 所述步骤（4）中凝胶过滤层析的具体操作为：填好SephacrylS-200柱料；用50mmol/LNaCl溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产柚苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；（3）离心分离液体发酵液，取上清液；（4）上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、Sephacryl S‑200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。
【技术特征摘要】
1.一种生产柚苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；
（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；
（3）离心分离液体发酵液，取上清液；
（4）上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
上述步骤（1）中，所述斜面培养基，每1L中含有以下成分：MgSO4 0.5g、KH2PO4 1.5g、CaCl2 0.1g、（NH4）2SO4 1.5g、KCl 0.5g、KNO3 1.5g、酵母膏 2g、桔皮粉15g、琼脂 20g，pH为6.0，1×105 Pa 灭菌20 min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
上述步骤（2）中，所述种子培养基，每1L中含有以下成分：
麦芽糖15.1g、胰蛋白胨 10g、（NH4）2HPO4 20g、NaCl 10g、酵母提取物 5g，pH为7.51；
或者，柚皮苷10g、胰蛋白胨10g、（NH4）2HPO4 20g、NaCl 10g、酵母提取物 5g，pH为7.51；
或者，MgSO4 0.5g、 KH2PO4 1.5g、 CaCl2 0.1g、（NH4）2SO4 1.5g、 KCl 0.5g、KNO3 1.5g、酵母膏 2、桔皮粉7.5g，pH 为6.0。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，
上述步骤（3）中，液体发酵液经超声波破壁后离心分离；超声波频率为25-30Hz，超声时间为10min，超声...
【专利技术属性】
技术研发人员：李秀婷，朱运平，杨然，伍少明，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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