本发明专利技术涉及一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，通过对单环刺螠体腔液冷冻离心、抽滤、真空冷冻干燥制得粗制品，进一步经过DEAE(二乙氨基乙醇)-Sepahcel(纤维素葡聚糖凝胶)阴离子交换层析和Sephadex(羟丙基葡聚糖凝胶)G-75层析、Benzamidine(苯甲脒)-Sepharose(琼脂糖凝胶)层析、冷冻干燥后经进一步测定证实为纤溶酶，后在大鼠脑颈内动脉栓塞模型上通过介入溶栓实验证实，单环刺螠纤溶酶具备完全溶解血栓的能力、无过敏等副作用。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，该生物制品，可以用于血栓性疾病的基础研究以及临床应用。
技术介绍
：血栓性疾病是因为血栓形成后直接或脱落后完全或部分阻塞血管、造成器官组织缺血坏死，是严重危害人类健康的一种循环系统疾病，已经占据全球疾病总死亡率的第一位，常表现急性心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓、肺动脉栓塞。目前，临床上血栓性疾病的主要治疗药物有抗血小板类药物、抗凝血药、溶血栓药物，后者是目前临床应用最广泛的治疗手段。溶血栓药又称为纤维蛋白溶解药，可激活纤溶酶而促进溶解血栓。第一代溶血栓药链激酶(SK)和尿激酶为代表。但其对纤维蛋白特异性差，主要不良反应是引起机体广泛出血，尤其是发生颅内出血的危险性很大，并发生再栓塞，它常常引起发热反应和其它如过敏反应等问题，抗原性强会产生大量的链激酶抗体。尿激酶也具有这些问题。第二代溶血栓药主要指组织型纤溶酶原激活物(如t-PA)等，t-PA又称为阿替普酶，与纤维蛋白有较好的亲和性而具有较强的血栓选择性，全身纤溶作用小，副作用小，然而其半衰期短(3分钟)，需短时间内大量给药，价格昂贵，而且有引起颅内出血的危险性。Sak在溶血栓速率和对纤溶酶原的保护方面均优于t-PA，但它有显著的免疫原性，不能重复使用。目前国际研发力量正在致力于应用蛋白质工程手段开发第三代溶血栓剂(如蚓激酶)等。蚓激酶是从特种蚯蚓中提取或分子重组的一类物质，兼有激酶和纤溶酶两种作用，对多种r>血栓疾病有较好的疗效，如治疗冠心病心绞痛、急性脑梗死、突发性耳聋、肾病综合征等多种疾病，但大多蚓激酶产品是非单一组分，并存在过敏等副作用。其他的第三代溶血栓药(瑞替普酶、降纤酶等)仍然存在着体内半衰期短、稳定性差、特异性和安全性有待进一步提高等问题。另外，这三代药物的共同问题是不能完全溶解新鲜和陈旧性血栓，即使介入溶栓也无法完全溶解血栓。因此，研发出血栓靶向性强而不易引起颅内出血等全身出血并发症、能够完全溶解血栓、免疫原性低的溶血栓药物和治疗措施是当务之急。本专利技术所研发的单环刺螠纤溶酶通过介入溶栓方法证实具备完全溶解血栓的能力、无过敏等副作用。
技术实现思路
：本专利技术提供了介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，包括以下步骤：(1)取鲜活单环刺螠，收集其体腔液，将温度控制在-20℃-4℃之间、离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，抽滤30-40分钟去除8KD(道尔顿)以上脂类不溶物，用PBS磷酸盐缓冲液透析8-10小时，真空冷冻干燥得到粗制品；(2)将粗制品溶解在50mM、pH 7.8的碳酸氢铵缓冲液中，将温度控制在-20℃-4℃之间、离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的1.7cm×15cm的DEAE-Sepahcel阴离子交换柱、并用50-800mM NaCl进行梯度洗脱、经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A5、A6，合并为A56备用；(3)将上述备用样品A56溶解在50mM、pH7.8的碳酸氢铵缓冲液，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，利用注射用水洗脱，经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A56-3备用；(4)将上述备用样品A56-3溶解在50mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、400mM NaCl、pH7.4的缓冲液中，注入经50mM Tris-HCl、400mM NaCl、pH7.4缓冲液平衡的Benzamidine-SepharoseTM 4Fast Flow(苯甲脒琼脂糖凝胶)层析柱中，利用100mM glycine-HCl(甘氨酸-盐酸)、pH3.0缓冲液进行洗脱，3ml/管的洗脱液含有0.5mL0.5M Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、pH9.0的缓冲液，经过纤维蛋白平板法测定的活性得到活性最高的部分就是单环刺螠纤溶酶A56-3-2。附图说明：图1为DEAE-Sephacel阴离子交换层析纯化单环刺螠纤溶酶粗制品A5、A6活性最高。图2为Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化单环刺螠纤溶酶流份A56-3活性最高。图3为Benzamidine-Sepharose亲和层析纯化单环刺螠纤溶酶流份A56-3-2活性最高。图4为RP-HPLC测定单环刺螠纤溶酶纯度纯化后的单环刺螠纤溶酶样品在99％以上。图5为单环刺螠纤溶酶(UFE)对大鼠颈内动脉血栓模型的溶解效果在脑梗塞模型建立2小时之后施入同剂量的UFE、阿替普酶(tPA)、尿激酶、相同体积的生理盐水，于22小时进行TTC染色。具体实施方式：以下所列实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本专利技术。(1)本专利技术中粗制品制备过程为，鲜活单环刺螠经无菌海水过夜培养以排净体内杂物，解剖收集体腔液，4℃下2000g冷冻离心30分钟，上清液经过400目绢布、3层滤纸抽滤去除脂类不溶物，装透析袋4℃过夜除盐，检验除盐效果，真空冷冻干燥得粗制品。(2)DEAE-Sepahcel阴离子交换层析：粗制品溶解在50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)，4℃下10000g冷冻离心10分钟，上清液注入经50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)平衡的DEAE-Sepahcel阴离子交换柱(1.7cm×15cm)，并用溶解在相同缓冲液的50-800mM NaCl进行梯度洗脱，利用在线紫外分光光度计(280nm)检测和收集(3ml/管)，UV280吸收峰处收集的样品进行真空冷冻干燥(命名为Al…n)，将经过纤维蛋白平板法测定的活性最高的A5、A6样品进行合并(命名A56)，继续下游纯化。[图1](3)Sephadex G-75凝胶过滤层析：将A56样品溶解在50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)，注入经50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)平衡的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，利用注射用水洗脱，利用在线紫外分光光度计(280nm)检测和收集(3ml/管)，280nm吸收峰处收集的样品进行真空冷冻干燥(命名为A56-1…n)，将经过纤维蛋白平板法测定的活性最高的A56-3样品继续下游纯化。[图2](4)Benzamidine-Sepharose亲和层析：A56-3样品溶解在50mM Tris-HCl，400mM NaCl(pH7.4)缓冲液中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，其特征在于：(1)取鲜活单环刺螠，收集其体腔液，将温度控制在‑20℃‑4℃之间、离心力控制在2000g‑10000g之间进行冷冻离心30‑35分钟，抽滤30‑40分钟去除8KD(道尔顿)以上脂类不溶物，用PBS磷酸盐缓冲液透析8‑10小时，真空冷冻干燥得到粗制品；(2)将粗制品溶解在50mM、pH7.8的碳酸氢铵缓冲液中，将温度控制在‑20℃‑4℃之间、离心力控制在2000g‑10000g之间进行冷冻离心30‑35分钟，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的1.7cm×15cm的DEAE‑Sepahcel阴离子交换柱、并用50‑800mM NaCl进行梯度洗脱、经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A5、A6，合并为A56备用；(3)将上述备用样品A56溶解在50mM、pH 7.8的碳酸氢铵缓冲液，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的Sephadex G‑75凝胶过滤层析柱，利用注射用水洗脱，经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A56‑3备用；(4)将上述备用样品A56‑3溶解在50mM Tris‑HCl(三羟甲基氨基甲烷‑盐酸)、400mM NaCl、pH＝7.4的缓冲液中，注入经50mM Tris‑HCl、400mM NaCl、pH 7.4缓冲液平衡的Benzami dine‑SepharoseTM 4Fast Flow(苯甲脒琼脂糖凝胶)层析柱中，利用100mM glycine‑HCl(甘氨酸‑盐酸)、pH3.0缓冲液进行洗脱，3ml/管的洗脱液含有0.5mL 0.5M Tris‑HCl(三羟甲基氨基甲烷‑盐酸)、pH9.0的缓冲液，经过纤维蛋白平板法测定的活性得到活性最高的部分就是单环刺螠纤溶酶A56‑3‑2。...
【技术特征摘要】
1.一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，其特征在于：
(1)取鲜活单环刺螠，收集其体腔液，将温度控制在-20℃-4℃之间、离心力控制在
2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，抽滤30-40分钟去除8KD(道尔顿)以上脂类
不溶物，用PBS磷酸盐缓冲液透析8-10小时，真空冷冻干燥得到粗制品；
(2)将粗制品溶解在50mM、pH7.8的碳酸氢铵缓冲液中，将温度控制在-20℃-4℃之间、
离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓
冲液平衡的1.7cm×15cm的DEAE-Sepahcel阴离子交换柱、并用50-800mM NaCl进行梯度洗
脱、经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板
法测定活性得到活性最高的样品A5、A6，合并为A56备用；
(3)将上述备用样品A56溶解在50mM、pH 7.8的碳酸氢铵缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈良海，
申请(专利权)人：陈良海，
类型：发明
国别省市：福建;35
0来自[北京市电信互联网数据中心] 2015年03月13日 13:05溶血（Hemolysis）红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，简称溶血。可由多种理化因素和毒素引起。在体外，如低渗溶液、机械性强力振荡、突然低温冷冻（-20℃～—25℃）或突然化冻、过酸或过碱，以及酒精、乙醚、皂碱、胆碱盐等均可引起溶血。