一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法技术

本发明专利技术属于细胞工程技术领域，具体涉及一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法。本发明专利技术公开了一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法，包括下列步骤：目的蛋白表达载体转染宿主细胞；筛选药物加压，稳定细胞池形成；稳定细胞池细胞接种于半固体培养基中；将细胞克隆从半固体培养基中挑至96孔细胞板中，继续培养4-5天，检测细胞上清中目的蛋白表达量；将表达量排名前50名的细胞扩至24孔板继续培养5天；将24孔板中细胞进一步扩至6孔板中继续培养5天；将6孔板中细胞扩至摇瓶中培养，检测评估不同细胞克隆在悬浮状态下的目的蛋白表达量；将根据摇瓶评估结果，将表达量排名前10名的细胞进行稳定性传代试验；根据细胞株表达目的蛋白的水平及持续表达蛋白的稳定性确立候选细胞株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞工程
，具体涉及一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法。
技术介绍
在整个生物制药行业中，约有70％蛋白药物是由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的。表达外源蛋白的细胞株构建技术一直是各大生物制药公司的核心技术之一。传统细胞筛选方法步骤较多(见图1)，具体为：1.目的蛋白表达载体转染CHO细胞。2.筛选药物加压，稳定细胞池形成。3.采用有限稀释法将稳定细胞池细胞接种96孔细胞培养板，并形成单克隆细胞群。4.96孔板中细胞扩大培养至24孔板。5.24孔板细胞进行表达量测定，评估不同细胞克隆的在24孔板阶段的表达量。6.24孔板细胞扩至6孔细胞板。7.将6孔细胞板中细胞扩增摇瓶中进行悬浮培养。8.在摇瓶中进行细胞培养并测定细胞上清中目的蛋白表达量，评估不同细胞克隆在摇瓶阶段的表达量。9.对摇瓶中表达量高的几个细胞株进一步进行亚克隆，将细胞再次才用有限稀释法接种至96孔细胞培养板中。10.对亚克隆细胞进行新一轮表达量评估，其过程同上。11.对细胞株进行连续传代，评估细胞株表达蛋白水平的稳定性。12.根据细胞株表达目的蛋白的水平及持续表达蛋白的稳定性确立几株候选细胞株。以上筛选方法往往耗时达10个月，需要大量人力物力支持，具体表现在：1.采用有限稀释法，为了确保获得的细胞克隆来自于同一个原始细胞，需要经过多轮的亚克隆，每一轮亚克隆需要将近3个月的时间。2.每个克隆需要从96孔扩至24孔，并进行表达量评估，这时的克隆有数千个，工作量非常大。3.将细胞从24孔中进一步扩大至摇瓶培养，评估不同细胞克隆在药瓶中的表达水平，这里摇瓶数量往往需要数百个，工作量大，且相关试剂耗材消耗很多。
技术实现思路
本专利技术目的在现有细胞株筛选过程繁杂、耗时耗工的问题，最终开发出了一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法。本专利技术公开了一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法，包括下列步骤：a)目的蛋白表达载体转染宿主细胞；b)筛选药物加压，稳定细胞池形成；c)稳定细胞池细胞接种于半固体培养基中；d)将细胞克隆从半固体培养基中挑至96孔细胞板中，继续培养4-5天，检测细胞上清中目的蛋白表达量；e)将表达量排名前50名的细胞扩至24孔板继续培养5天；f)将24孔板中细胞进一步扩至6孔板中继续培养5天；g)将6孔板中细胞扩至摇瓶中培养，检测评估不同细胞克隆在悬浮状态下的目的蛋白表达量；h)将根据摇瓶评估结果，将表达量排名前10名的细胞进行稳定性传代试验；i)根据细胞株表达目的蛋白的水平及持续表达蛋白的稳定性确立候选细胞株。在一些实施方案中，所述目的蛋白为抗体，所述抗体为贝伐珠单抗。在一些实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞。在一些实施方案中，所述步骤c中接种细胞浓度为每毫升半固体培养基中含250个细胞。在一些实施方案中，所述半固体培养培养基为Molecular Devices公司产品，货号：K8750，K8712，K8725。本专利技术与传统方法相比较：1.减少细胞株构建工作量。研究发现，各细胞株摇瓶悬浮培养表达量前10名，包含在96孔细胞培养上清的前50名之内(见图3)。因此，只要将96孔板阶段的细胞克隆前50名细胞株直接放大至摇瓶悬浮培养评估，其余50名之外的细胞株不需要进一步扩至摇瓶评估表达量，可以全部丢弃。这样大大减少了工作量。2.缩短细胞株构建时间传统方法构建细胞株需要经过多轮的亚克隆步骤，每增加一轮亚克隆筛选，需要增加2-3个月的时间。而本专利技术中采用半固体培养法，在细胞接种半固体前对细胞进行充分分散，这样在半固体中由单个细胞生长而成的细胞克隆，来自于同一个原始细胞，不需要进一步做亚克隆。此外，传统方法在细胞株进入摇瓶前，在24孔板或者6孔板阶段进行表达量评价，这样也会增加1-2个月的时间。本专利技术工艺与传统方法不同的是，在96孔板阶段，检测不同克隆表达量，对其进行表达量高低排名，只关注96孔板阶段的表达量前50的细胞株并将其直接放大至摇瓶进行表达量评估，中间在24孔及6孔板阶段不进行评估，这也缩短了细胞株构建时间。附图说明图1传统细胞株筛选流程图；图2本专利技术一优选细胞株筛选流程图；图3不同细胞株培养上清中目的蛋白表达量排序。A为96孔板阶段；B为摇瓶阶段；图4细胞株表达量稳定性评估。具体实施方式除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，为进一步详细描述在本专利技术的实践中所使用的常规技术，实践者可参看有关细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括Teratocarcinomas and embryonic stem cell：A practical approach[E.J.Robertson编，IRL出版有限公司，1987]；Guide to techniques in Mouse Development[P.M.Wasserman等编，学术出版社，1993]；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro[M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900，1993]；Properties and uses of Embryonic Stem Cells：Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy[P.D.Rathjen等，Reprod.Fertil.Dev.10：31，1998]。细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在“蛋白科学中的当前方案”[J.E.Colligan等编辑，Wiley & Sons]、“细胞生物学中的当前方案”[J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons]和“兔疫学功时当亦方案”[J.E.Colligan等编辑，Wiley & Sons]中找到。与本专利技术相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech以及sigma-Aldrich公司。细胞培养方法通常在“动物细胞培养：基本技术手册”最新版本(R.I.Freshney编辑，Wiley&Sons)；“细胞培养一般技术”(M.A.Harrison和I.F.Rae，剑桥大学出版)；和“胚胎干细胞：方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法，包括下列步骤：a)目的蛋白表达载体转染宿主细胞；b)筛选药物加压，稳定细胞池形成；c)稳定细胞池细胞接种于半固体培养基中；d)将细胞克隆从半固体培养基中挑至96孔细胞板中，继续培养4‑5天，检测细胞上清中目的蛋白表达量；e)将表达量排名前50名的细胞扩至24孔板继续培养5天；f)将24孔板中细胞进一步扩至6孔板中继续培养5天；g)将6孔板中细胞扩至摇瓶中培养，检测评估不同细胞克隆在悬浮状态下的目的蛋白表达量；h)将根据摇瓶评估结果，将表达量排名前10名的细胞进行稳定性传代试验；i)根据细胞株表达目的蛋白的水平及持续表达蛋白的稳定性确立候选细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法，包括下列步骤：
a)目的蛋白表达载体转染宿主细胞；
b)筛选药物加压，稳定细胞池形成；
c)稳定细胞池细胞接种于半固体培养基中；
d)将细胞克隆从半固体培养基中挑至96孔细胞板中，继续培养4-5天，检
测细胞上清中目的蛋白表达量；
e)将表达量排名前50名的细胞扩至24孔板继续培养5天；
f)将24孔板中细胞进一步扩至6孔板中继续培养5天；
g)将6孔板中细胞扩至摇瓶中培养，检测评估不同细胞克隆在悬浮状态下的
目的蛋白表达量；
h)将根据摇瓶评估结果，将表达量排名前10名的细胞进行稳定性传代试验；
i)根据细胞株表达目的蛋白的水平及持续表达蛋白的稳定性确立候选细胞
株。
2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述目的蛋白为抗体。
3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于所述抗体为贝伐珠单抗。
4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，王佳龙，都业杰，
申请(专利权)人：上海美百瑞生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31