一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法，它以二倍体泥鳅、四倍体泥鳅和大鳞副泥鳅为繁殖亲本进行杂交获得杂交受精卵，在获得受精卵的第5分钟时，将杂交受精卵浸泡在2-3℃冰水中进行冷休克处理，处理的持续时间为30-35分钟，最后在室温条件下进行孵化，饲养，获得泥鳅异源多倍体。该方法分别获得异源三倍体泥鳅、异源四倍体泥鳅以及异源五倍体泥鳅，其诱导泥鳅异源多倍体种类多，数量大，诱导成功率高，后代生长快，12月龄比正常自交对照组体重平均增加-19.99％～142.34％，增重效果明显，具有较强的推广效益。

【技术实现步骤摘要】
一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法
本专利技术涉及鱼类杂交选育以及多倍体育种领域，更具体地说，它涉及一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法。
技术介绍
泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)和大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)是我国重要的两种淡水经济鳅类，2011年我国两种鳅类产量超过23万吨。两种鳅类除了我国西藏高原地区外，全国其他地区均有分布。近年来，由于自然资源的锐减，野生捕捞泥鳅远远不能满足市场的需要，开展泥鳅育种，选育优良品种的任务迫在眉睫。在鱼类育种工作中，常用的两种技术包括：杂交选育以及多倍体育种。杂交育种后代通过筛选可以获得遗传了两个甚至多个物种或地理群体的优势，在生长速度、抗逆性、抗病性和肉质等方面都表现出杂种优势。比如湖南师范大学利用红鲫和湘江野鲤进行属间杂交形成的杂交后代在生长速度、肉质、抗病力以及存活率都表现出了杂种优势。同时，由于多倍体鱼类在生长速度和可育性方面表现出了一定的优势，使得多倍体选育在鱼类育种中占据重要位置。鱼类诱导多倍体的方式有两种方式，一是通过休克抑制卵子第二极体的释放获得三倍体，二是通过抑制受精卵第一次有丝分裂获得四倍体。根据受精卵的来源不同，可以分为同源多倍体和异源多倍体。通过休克抑制自交后代获得的多倍体称之为同源多倍体，而通过休克抑制杂交后代获得的多倍体称之为异源多倍体。迄今为止，国内外学者陆续开展了水晶彩鲫，鲤鱼、罗非鱼、虹鳟等鱼类的同源四倍体诱导，而异源四倍体的诱导主要是通过远缘杂交自发形成获得，如远缘杂交四倍体“湘云鲫”以及兴国红鲤和红鲫杂交后代四倍体。中国专利CN1969616A公开了一种诱导团头鲂和三角鲂杂交异源四倍体的方法，获得团头鲂异源四倍体群体，但诱导成功率不高。目前，通过理化方法获得同源或异源多倍体成功的案例较少，主要表现在诱导率低、畸形率高以及嵌合体比率高等，从而导致诱导四倍体难以存活下来，难以建立较大规模的稳定群体。而通过抑制卵子第二极体的释放获得诱导三倍体成功的案例较多，在虹鳟、黄颡鱼、真鲷、大黄鱼都相继获得成功，诱导成功率高，后代存活率明显高于诱导四倍体。我国有较为丰富的泥鳅资源，特别是湖北地区同时分布有二倍体泥鳅(2N＝50)和四倍体泥鳅(4N＝100)野生资源，同时还广泛分布有其近缘物种大鳞副泥鳅(2N＝48)，为研究泥鳅的杂种选育以及研究鱼类多倍体的发生提供了优良的研究材料。将杂交育种和多倍体育种两种方法相结合，培育泥鳅异源多倍体不仅能够扩大杂交优势，而且生产出的不育或生殖障碍的后代可以避免遗传污染问题。目前，关于泥鳅异源多倍体诱导的系统研究，国内外尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法，通过该方法可获得高比例的异源多倍体泥鳅。上述目的是通过以下技术方案实现的：一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法，该方法是：以二倍体泥鳅、四倍体泥鳅和大鳞副泥鳅为繁殖亲本进行杂交获得杂交受精卵，在获得受精卵的第5分钟时，将杂交受精卵浸泡在2-3℃冰水中进行冷休克处理，处理的持续时间为30-35分钟，最后在室温条件下进行孵化，饲养，获得泥鳅异源多倍体。所述二倍体泥鳅、四倍体泥鳅和大鳞副泥鳅亲本来源于野生群体，选择发育良好，无病无害个体用作繁殖亲本。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术综合利用了杂交技术和染色体组操作技术培育出新型的泥鳅群体，分别获得异源三倍体泥鳅、异源四倍体泥鳅以及异源五倍体泥鳅，其诱导率高达81.25％-100％；2、本专利技术提供的方法诱导泥鳅异源多倍体种类多，数量大，诱导成功率高，后代生长快，12月龄比正常自交对照组体重平均增加-19.99％-142.34％，增重效果明显；3、本专利技术采用的方法是利用冰水对受精卵进行冷休克处理，操作简单，材料易得，操作过程无毒无害，对操作者和受精卵均无毒性；该方法同时适用于诱导其他鱼类异源多倍体，具有较强的推广效益。附图说明图1是利用流式细胞仪对异源多倍体泥鳅倍性鉴定结果，参照为二倍体的大鳞副泥鳅红细胞。图中，a:诱导杂交组合获得异源五倍体泥鳅检测图；b:诱导杂交组合获得异源五倍体泥鳅检测图；c:诱导杂交组合获得异源四倍体泥鳅检测图；d:诱导杂交组合获得异源三倍体泥鳅检测图。图2是利用荧光染料(DAPI)对受精卵进行追踪。图中，a示杂交受精卵冷休克处理后发育至第50分钟卵细胞受精核和极体变化；b示杂交受精卵不经过冷休克正常发育至第50分钟卵细胞受精核。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步地详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1最佳诱导条件的建立本专利技术利用物理方法(冷休克处理)诱导泥鳅异源多倍体，主要是通过抑制受精卵第二极体的释放获得异源多倍体泥鳅。按照三因素实验设计原理，将实验条件(休克开始时间、休克温度和休克处理时间)分别进行梯度设计，休克开始时间分别为受精后第4分钟、第5分钟、第6分钟；休克温度分别为1℃、2℃、3℃、4℃；休克处理持续时间分别为25分钟、30分钟、35分钟。每个实验组设计2个平行，通过统计胚胎成活率以及诱导多倍体成功率确定合适的诱导条件用于后续实验。本专利技术优选的休克开始时间为受精后第5分钟；休克温度为2-3℃；休克处理时间为30-35分钟。此时的胚胎成活率以及诱导多倍体成功率最高。实施例2泥鳅异源多倍体的建立首先从湖北省武汉市周边水域，捕捞野生泥鳅。挑选发育良好，无病无伤作为繁殖亲本。在实验室内利用流式细胞仪(Beckman,QuantaSC)鉴定其血细胞DNA含量用于判别其倍性。通过对繁殖亲本注射催产药物，所用催产药物是促排卵素2号(LRH-A2)和地欧酮(DOM)，雌鱼的注射剂量为LRH-A235μg/kg+DOM4mg/kg，雄鱼剂量减半，注射方法为腹腔一次注射法。催产药物注射后，将雌雄鱼分开暂养于不同水箱中，水温24-26℃。注射催产药物12-15小时后，解剖雄鱼取出精液，将精巢与精子保存液(保存液配方：氯化钠7.5g，氯化钾0.3g，氯化钙0.3g，葡萄糖3.0g，蒸馏水定容到1000mL)充分研磨过滤；再挤出不同种类泥鳅成熟雌鱼的卵粒，与精子进行混匀，加曝气水激活受精。通过观察受精卵胚胎发育情况，在第二极体排出前利用冰水对受精卵进行冷休克处理。通过实施例1最佳诱导条件的摸索，实施例2具体诱导条件为受精后第5分钟后开始冷休克处理，2-3℃冰水持续休克30分钟。通过冷休克处理后，受精卵在室温条件下进行孵化，饲养孵化获得的泥鳅苗，首先投喂鲜活卤虫饲养，卤虫饲养5-7天后，再使用商品配合饲料饲养至成鱼。按照自交和杂交，杂交分为正交和/或反交进行人工受精，获得四个杂交诱导组合()以及三个自交组合对照组()，杂交诱导组合受精卵按照上述方法进行冰水冷休克处理，自交组正常受精后不休克处理。按月对杂交诱导组和正常对照组进行生长指标的测量(表1)。表1泥鳅异源多倍体生长状况注：组合中2n、4n、大分别代表亲本信息；全长：mm；体重：g；前三组为正常自交对照组，后四组为诱导异源多倍体组合；数字右上角字母表示显著性分析。对诱导异源多倍体泥鳅进行长期饲养，定期测量其生长状况。由表1结果可以看出，生长前期(1月龄)各正常自交对照组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法，其特征在于：以二倍体泥鳅、四倍体泥鳅和大鳞副泥鳅为繁殖亲本进行杂交获得杂交受精卵，在获得受精卵的第5分钟时，将杂交受精卵浸泡在2‑3℃冰水中进行冷休克处理，处理的持续时间为30‑35分钟，最后在室温条件下进行孵化，饲养，获得泥鳅异源多倍体。

【技术特征摘要】
1.一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法，其特征在于：以雌性四倍体泥鳅和雄性大鳞副泥鳅为繁殖亲本进行杂交获得杂交受精卵，在获得受精卵的第5分钟时，将杂交受精卵浸泡在2-3℃冰水中进行冷休克处理，处理的持续时间为30-35...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄松钱，曹小娟，田先畅，王卫民，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42