一种包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺-氧化钛及其制备方法，属于固定化酶技术领域。该包埋有胺脱氢酶的聚乙烯亚胺(PEI)-氧化钛固定化颗粒，粒径为100～600nm，其中PEI在固定化过程中具有催化和模板双重作用，即PEI通过分子中的氨基基团与钛前驱体分子之间的静电和氢键作用促进氧化钛的形成，又能通过PEI的结构为模板诱导并调控氧化钛粒子的生成。其制备方法过程包括：配置PEI(直链和支链)及含有胺脱氢酶混合液；配置钛的前驱体二-(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛(Ti-BALDH)溶液；将钛的前驱体溶液逐滴加入到PEI及胺脱氢酶的混合液，搅拌生成包埋胺脱氢酶的PEI-氧化钛固定化颗粒。本发明专利技术的优点在于：制备条件温和，工艺简单易行，所得包埋固定化颗粒具有固定化能力强，重复使用稳定性好且能够明显提高胺脱氢酶的温度稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺-氧化钛及其制备方法。
技术介绍
手性胺是很多重要生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。大概40％的光学活性药物是手性胺。同时，手性胺可以为用作为拆分剂、手性助剂和手性合成物，在精细化工、制药和农用化学品中得到广泛的应用。当前，在化工和制药产业中生物催化法制备手性化合物应用广泛，而且具有广阔前景。酮和游离氨不对称还原胺化制备手性胺是目前应对大规模生产最梦寐以求的反应，所以，寻找提高胺脱氢酶活性和稳定性的方法至关重要。胺脱氢酶其高级结构对环境十分敏感，极端的温度和pH均有可能使酶丧失活力，即使在酶的适宜反应条件下，随着反应时间的延长，酶也会逐渐丧失活性；另一方面，酶难以从反应体系中回收，酶的存在会给产物的分离带来一定的困难。而固定化酶技术是目前提高酶使用效率和实现操作连续的最有效的手段之一。利用生物硅化研究的基础，将仿生思想应用到其他氧化物的合成上逐渐成为研究热点。仿生矿化的过程可在常温水溶液中进行，温和的制备条件使得酶分子的天然构象和生物活性得到很好的保持，为固定化酶提供了适宜的微环境。2002年，Livgae课题组报道了利用仿生杂化微囊固定化酶，将海藻酸钙微球侵入聚赖氨酸溶液，再浸入硅酸钠溶液中进行硅化，微球表面形成氧化硅外壳，利用柠檬酸盐的置换作用，进一步得到具有海藻酸液核和氧化硅外壳的杂化微囊，具有较高的机械强度。将相对分子量为135KDa的牛乳糖酶包埋于上述杂化微囊中，硅化后固定化酶比活力稍有下降，但重复使用过程中未发生酶泄漏现象，表现出较高的重复使用稳定性。但胺脱氢酶由于敏感，目前高效固定化还较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺(PEI)-氧化钛及其制备方法。所述的包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺(PEI)-氧化钛固定化颗粒的制备方法，包括以下步骤：1)全基因合成胺脱氢酶序列，设计引物，扩增基因序列，并将其连接至pET28a载体，之后将该质粒导入至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)；粗酶液制备：将步骤1)大肠杆菌菌种接种到含有卡那霉素的LB培养基中培养，培养一段时间后加入诱导剂IPTG；培养所得发酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；超声破碎，将破碎液离心，收集上清液即为粗酶液；2)胺脱氢酶纯酶的制备：采用镍柱对胺脱氢酶进行纯化并除盐；3)配备以及5～100mg/ml聚乙烯亚胺(PEI)溶液，向该PEI溶液中加入3)所得的胺脱氢酶配置成混合溶液，制备含0.25～2mg/ml胺脱氢酶的混合溶液；4)配置的钛的前驱体二‐(2‐羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛溶液，溶剂为水，并用盐酸调节pH 5.0‐10.0；5)将步骤5)的溶液逐滴加入到4)配置的胺脱氢酶-PEI混合液中，同时不断搅拌孵化生成的颗粒，过滤后，用去离子水洗涤，即可获得包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺‐氧化钛固定化颗粒。其中，在步骤1)中所述的胺脱氢酶，其基因序列如SEQ ID NO 1所示。其中，在步骤1)中，正向引物为F:GAA TTC CCA TAT GAG CTT AGT AGA；划线部分为NdeI酶切识别位点；反向引物为R:GCC CTC GAG TTA GTT GCG AAT划线部分为XhoI酶切识别位点；PCR产物与载体pET28a的连接：使用NdeI与XhoI将PCR产物及载体pET28a双酶切，经纯化后在T4DNA ligase作用下4℃过夜反应。其中，步骤2)中的优选操作为：所述的接种量为1％～3％，所述的LB培养基的组成为：胰蛋白胨5.0～15.0g/L，酵母浸膏1.0～10.0g/L，NaCl5.0～15.0g/L，调节pH7.0～7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为50～150ug/mL；所述培养条件为37℃，150～250rpm培养1.5～3h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养4～6h。在步骤2)中所述的细胞悬液制备方法为培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(优选为4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-盐酸缓冲液(pH6.5-8.0)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次。所述的配置细胞液浓度为50～150g/L。在步骤2)中的超声破碎时的优选操作为：将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，功率200W，超声2sec，间隔4sec，超声20～60次。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为胺脱氢酶粗酶液。在步骤2)中所述的纯化过程优选采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为胺脱氢酶纯酶液体。在步骤3)中所述的聚乙烯亚胺(PEI)包括分子量20-500KDa的直链PEI(优选为分子量为22KDa，87KDa，217KDa)与分子量20-500KDa的支链PEI(优选分子量为25KDa，187KDa)两种，其浓度范围为5～100mg/ml。在步骤3)中制备含有胺脱氢酶的PEI混合液，将胺脱氢酶与PEI母液按照一定的体积比混合，其中胺脱氢酶的浓度范围为0.25～2mg/ml。在步骤4)中所述的钛的前驱体二-(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛(Ti-BALDH)溶液，其浓度为0.1～0.5mol/L，采用的溶剂为去离子水。酶活力的检测方法：将底物和还原性辅酶Ⅰ二钠加到2mL 200mM的氯化铵-氨水缓冲液中，配置使得底物浓度为20mM，还原性辅酶Ⅰ二钠浓度为0.2mM，加入制备的胺脱氢酶液，在25℃，搅拌条件下进行还原胺化反应，用紫外分光光度计测定还原型辅酶Ⅰ二钠的转化量，得到固定化胺脱氢酶的酶活力。所述的底物为苯氧基-2丙酮、4-甲基-2-戊酮(MIBK)、苯乙酮、5-甲基-2-己酮、环己酮中的一种，其中优选苯氧基-2-丙酮。分离与检测：反应液加入等体积的正己烷，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用。用高效液相色谱检测，计算产物苯丙氨酸的收率及e.e.值。底物苯氧基-2-丙酮和产物苯氧基-2-丙酮用高效液相色谱检测，色谱柱为DaicelOD-H，检测波长254nm(附图5)。其检测条件为：流动性为体积比为90/10/0.1的正己烷/乙醇/二乙胺；流速为1ml\本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺‑氧化钛固定化颗粒，其特征在于该包埋胺脱氢酶的PEI‑氧化钛固定化颗粒，粒径为100～600nm。
【技术特征摘要】
1.一种包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺-氧化钛固定化颗粒，其特征在于该包埋胺脱氢酶的PEI-氧化钛固定化颗粒，粒径为100～600nm。
2.如权利要求1所述的包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺‐氧化钛固定化颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)全基因合成胺脱氢酶序列，设计引物，扩增基因序列，并将其连接至pET28a载体，之后将该质粒导入至大肠杆菌E.coliBL21DE3；
2)粗酶液制备：将步骤1)大肠杆菌菌种接种到含有卡那霉素的LB培养基中培养，培养一段时间后加入诱导剂IPTG；培养所得发酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；超声破碎，将破碎液离心，收集上清液即为粗酶液；
3)胺脱氢酶纯酶的制备：采用镍柱对胺脱氢酶进行纯化并除盐；
4)配备以及5～100mg/ml聚乙烯亚胺溶液，向该PEI溶液中加入3)所得的胺脱氢酶配置成混合溶液，制备含0.25～2mg/ml胺脱氢酶的混合溶液；
5)配置的钛的前驱体二‐(2‐羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛溶液，溶剂为水，并用盐酸调节pH 5.0‐10.0；
6)将步骤5)的溶液逐滴加入到4)配置的胺脱氢酶-PEI混合液中，同时不断搅拌孵化生成的颗粒，过滤后，用去离子水洗涤，即可获得包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺‐氧化钛固定化颗粒。
3.如权利要求2所述的包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺‐氧化钛的制备方法，其特征在于：步骤1)中，设计引物序列如下：
正向引物F:GAA TTC CCA TAT GAG CTT AGT AGA；划线部分为NdeI酶切识别位点；
反向引物R:GCC CTC GAG TTA GTT GCG AAT划线部分为XhoI酶切识别位点；
PCR产物与载体pET28a的连接：使用NdeI与XhoI将PCR产物及载体pET28a双酶切，
经纯化后在T4DNA ligase作用下4℃过夜反应。
4.如权利要求2所述的包埋胺脱氢酶的聚乙烯亚胺‐氧化钛的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的接种量为1％～3％，所述的LB...
【专利技术属性】
技术研发人员：王世珍，任红，方柏山，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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