一种用于检测番茄斑萎病毒的NASBA方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种用于检测番茄斑萎病毒的NASBA方法，所用于检测TSWV的NASBA引物，其引物序列分别为SEQ ID NO:1～2。发明专利技术根据TSWV的N基因高度保守区的设计了两个特异性内引物，该保守基因序列为具有TSWV的不同株系所共有，以保证从株系的水平上检测不同来源的TSWV的可靠性。本发明专利技术适用于对TSWV进行快速检测确证，可广泛应用于生产和环境中的病害监控、进出口贸易中该病毒的确证。

【技术实现步骤摘要】
-种用于检测番茄斑萎病毒的NASBA方法
本专利技术属于植物病原检测
，具体涉及一种用于检测番茄斑萎病毒的 NASBA方法。
技术介绍
近年来，番爺斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV)以其广泛的寄主范围 和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。在20世纪60?80 年代，该病毒曾在欧美及非洲的烟草和番茄上大流行，每年的发病率为20 %?50 %，造成 高达数10亿美元的损失。在美国夏威夷、巴西、意大利和南非，TSWV在20世纪80?90年 代的流行曾导致番茄、莴苣等作物近乎绝产。近年来，番茄斑萎病毒属病毒特别是TSWV，已 成为全世界引起多种经济作物和观赏植物极大经济损失的重要因子。 我国目前种植的辣椒、洋葱、生菜等蔬菜种子很多来自于世界各地，尤其是番茄种 子基本依赖进口，进口国别包括美国、日本、荷兰、泰国等国，这些进口国目前都有番茄斑萎 病毒的发生与报道，我国口岸曾于2012年在进境的种子中截获TSWV病毒。而传统的TSWV 检测及确证方法一般通过生物寄主、形态学试验判定植株是否具有植物病毒，这些方法费 时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要。 目前针对该病毒的检疫鉴定主要局限在电镜技术、血清学技术以及RT-PCR等传 统检测技术，如ELISA方法，分子杂交，荧光定量PCR方法，普通PCR方法等等，但在这些方 法中，血清学、杂交技术检测灵敏度低，操作步骤繁琐，周期长；电镜、荧光PCR技术依赖大 型仪器，因此很多实验室在仪器配置和检测能力上无法达到要求。另外，由于番茄斑萎病毒 为单链RNA病毒，易于降解，以上方法操作的复杂性与灵敏度限制了对该病的检测与预报。 应用PCR技术检测虽然灵敏，但目前的检测实践表明经常出现检测假阳性或假阴性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测TSWV的NASBA方法，即利用具有高灵敏性和特 异性的引物引导，在含有T7RNA聚合酶、RNAseH、反转录酶AMV、NTP、dNTP及反应缓冲液所 组成的反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增，对 样品中的番茄斑萎病毒进行准确的检测。 本专利技术首先提供一种用于检测TSWV的NASBA引物，其引物序列分别为SEQ ID N0:1 ?2。 NA-P1:5 ' -aattctaatacgactcactatagggagTGTCAGTGGCTCCAATCCTG-3 ' NA-P2:5 ' -aattctaatacgactcactatagggagGCTTTGTTGACACAAGGCAAAG-3 '。 本专利技术还提供一种检测TSWV的试剂盒，包含有如下的组分 I) NASBA扩增反应液A : 每 25μ L 包括 10XAMV buffer 2· 5μ 1，6· 25mmol/L NTPs 3μ L，lOmmol/L dNTPs I. 5 μ L，10 μ mol/L 弓丨物 ΝΑ-PI、NA-P2 各 0· 5 μ L，双蒸水 9ml ; 其中 10XAMV buffer 为含 40mmol/L ΡΗ8· 5 的 Tris-HCL，70mmol/L KCL，12mmol/ L MgCL2,5mmol/L DTT 的缓冲液； 2) NASBA扩增反应液B: 所述的NASBA扩增反应液B包含有：0· 5U RNaseH，32U T7RNA聚合酶，6. 4U AMV反 转录酶,2 μ L DMS0,0· 1 μ Llmol/L 二硫苏糖醇，0· 25 μ L lOmg/mL BSA，20U RNA 酶抑制剂， 上述的试剂盒用于检测TSWV，包含有如下的步骤： 1)样品RNA的提取 A、取0. Ig样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入 1mT, Trizol Reagent，颠倒混勻，2°C?8°C，12000g，离心 IOmin ; B、取上清，15°C?30°C，放置5min;加入0. 2mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振 荡），约 15s，15--3(TC，放置 2min ?3min ;2°C?8°C，12000g，离心 15min ; C、吸取600μ?的上层水相，加500μ?异丙醇混合上清液，15°C?30°C，放置 IOmin ;2°C?8°C，12000g，离心 IOmin ; D、去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗涤；2°C?8°C，7500g，离心5min ; E、去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μ L?50 μ L无 RNase的水中，即为 待检模板RNA ; 2)进行 TSWV 的 NASBA 扩增 Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检 Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA， Β、在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5min ; C.在反应管中迅速加入4 μ L反应液B ; D.于 41°C 温育 2h; E.将金属浴调到4 C中止反应，3min后取出； 3)电泳检测 取3g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓 度为0. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移 至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。如果扩增片段为235bp，说明待检病毒是 TSWV，如果没有出现235bp扩增片段，则说明待检病毒不是TSWV。 本专利技术根据TSWV的N基因高度保守区的设计了两个特异性内引物，该保守基因序 列为具有TSWV的不同株系所共有，以保证从株系的水平上检测不同来源的TSWV的可靠性。 本专利技术适用于对TSWV进行快速检测确证，可广泛应用于生产和环境中的病害监控、进出口 贸易中该病毒的确证。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括： 第一，便捷性。该专利技术在进行恒温扩增时，不需要昂贵的核酸扩增反应装置，整个 过程始终在42°C进行，无需热循环仪，仅1个普通的恒温水浴锅就可完成。 第二，精确度高。该专利技术酶循环反应的循环数少，不需高温变性步骤，相对于 RT-PCR错配率较低，更适于检测和定量特异RNA。 第三，灵敏度高。该专利技术比起PCR技术，能用较少的循环便扩增出大量的目的基 因，保证了检测的高敏感性。 第四，缩短周期。由于反转录过程被直接合并到扩增反应中，PCR大约需要20轮 循环才能扩增IO 6倍，而NASBA只需循环4?5轮即可达到IO6倍。 第五，降低了对植物RNA模板的质量要求。由于细胞壁中富含大量的多糖、酚类物 质，植物病毒RNA的提取存在着稳定性差、重复性低、效率低等问题，加之在提取过程中RNA 本身的自降解现象，病毒RNA的含量往往较低，对检测方法的灵敏度和稳定性提出了较高 要求。由于该专利技术针对的模板是RNA，反应的产物也本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测番茄斑萎病毒的NASBA扩增引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物、下游引物的序列分别为SEQ ID NO:1～2。

【技术特征摘要】
1. 一种检测番茄斑萎病毒的NASBA扩增引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引 物、下游引物的序列分别为SEQ ID NO: 1?2。2. 权利要求1所述的引物对在检测植物样品中番茄斑萎病毒的应用。3. -种检测番茄斑萎病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分： 1. NASBA扩增反应液A : 每 25iiL 包括 10XAMV buffer 2.5iil，6.25mmol/L NTPs 3iiL，10mmol/L dNTPs 1. 5 ii L，10 ii mol/L 引物 NA-P1、NA-P2 各 0? 5 ii L，双蒸水 9ml ;其中引物 NA-P1、NA-P2 为权 利要求1所述的上游引物、下游引物； 其中 10XAMV buffer 为含 40mmol/L PH8. 5 的 Tris-HCL，70mmol/L KCL，12mmol/L MgCL2,5mmol/L DIT 的缓冲液； 2. NASBA扩增反应液B: 所述的NASBA扩增反应液B包含有：0. 5U RNaseH，32U I7RNA聚合酶，6. 4U AMV反转录 酶，2 ii L DMS0,0? 1 ii Llmol/L 二硫苏糖醇，0? 25 ii L 10mg/mL BSA，20U RNA 酶抑制剂。4. 权利要求3所述的试剂盒在检测植物样品中番茄斑萎病毒的应用。5. -种使用权利要求3所述的试剂盒检测植物样品中番茄斑萎病毒的方法，其特征在 于，所述的方法包括如下的步骤： 1) 样品RNA的提取 A、 取0. lg样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入l...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴兴海，陈长法，封立平，王简，尼秀媚，王英超，张云霞，余冬冬，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37