本发明专利技术提供了一种人白细胞介素-29(hIL-29)成熟肽第33位赖氨酸定点突变为精氨酸的重组hIL-29变异体(rhIL-29L)及其制备方法，属于生物工程领域。本发明专利技术的具体制备方法包括以下步骤：1)人工设计合成hIL-29成熟肽的上下游引物和定点突变引物；2)用上下游引物及突变引物对hIL-29成熟肽编码基因第98位碱基进行定点突变；3)构建含hIL-29变异体编码基因的重组真核表达载体，转化毕赤酵母，获得重组酵母工程菌；4)培养重组酵母工程菌，于培养液添加1.5％(v/v)甲醇诱导其表达hIL-29变异体；5)采用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析从培养液上清纯化hIL-29变异体。本发明专利技术构建的重组酵母工程菌可进行高密度培养并分泌表达rhIL-29L，适用于工业化制备rhIL-29成熟肽变异体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种人白细胞介素_29成熟肽第33位赖氨酸定点突变为精氨酸的 重组变异体（rhIL-29L)及其制备方法，属于生物工程领域。
技术介绍
人白细胞介素-29 (interleukin 29, IL-29)是近年发现的一种新的细胞因子，其 结构和功能与I型干扰素（interferon，IFN)相似，因此又称为IFN-λ 1。 人IL-29基因定位于19号染色体长臂（19ql3. 13)，包含5个外显子，其基因结构 与IL-10家族成员的基因结构相似，但与I型干扰素的基因结构（只含一个外显子）有明显 差异。IL-29由含19个氨基酸的信号肽和181个氨基酸的成熟肽组成，其mRNA全长856bp， 开放读码框为603bp。IL-29的相对分子质量约为20000?33000,有一个潜在的N-连接糖 基化位点，有两个二硫键。二硫键对IL-29的正确折叠和生物学活性十分重要。 人IL-29通过与细胞膜上的受体复合物结合，起始信号的转导和发挥生物学作 用。IL-29和IL-28共用一个由IL-28R1和IL-10R2组成的异二聚体受体复合物，其中 IL-28R1为结合亚基，IL-10R2为辅助亚基。IL-28R1是IL-29和IL-28的共用受体中所特 有的结合亚基，对IL-29的细胞应答具有特异性，辅助亚基IL-10R2是I型干扰素、IL-10、 IL-22和IL-26的受体组成部分，其在造血和非造血细胞中普遍表达，对IL-29的细胞应答 无特异性。 人 IL-29 与 I 型干扰素共享相同的 Jak-STAT (janus kinase-signal transducer of transcription)信号传导途径，激活相同的Jak-STAT信号转导途径，促进一组共同的 基因表达。IL-29首先与其受体结合形成IL28R1-IL29-IL10R2三元络合物，然后通过定 位在细胞内的两条受体链转导信号，启动信号级联反应，使STAT1、STAT2、STAT3、STAT4和 STAT5 的酪氨酸残基憐酸化，促使 ISGF3(IFN_stimulated gene factor 3complex)进入细 胞核与ISRE(IFN-stimulated response element)相互作用，从而调节基因的转录。因此， IL-29表现出一些与I型干扰素相同的性质，如抗病毒、抗增殖、体内抗肿瘤以及免疫调节 等生物学活性。 研究发现，人IL-29主要在上皮细胞中进行表达，在人血液、大脑、肺、胰脏及睾 丸中则有低水平的表达。不同起源的造血和非造血细胞被各种病毒感染后，可诱导表达 IL-29,目前已发现有麻疹病毒、腮腺炎病毒、心肌炎病毒、甲型流感病毒、仙台病毒、新城鸡 瘟病毒、单链（+) RNA病毒、双链DNA病毒等可诱导感染细胞表达IL-29。 IFN是发现最早、研究最多、第一个克隆化和用于临床治疗疾病的细胞因子。目前， IFN主要用于某些肿瘤和病毒性疾病的治疗，但对不同的肿瘤和病毒性疾病的疗效差异很 大，且常出现不良反应。IL-29的结构和功能与I型IFN相似，且能选择性地作用于不同类 型的靶细胞，其可作为I型IFN(IFN-a、IFN-β)的替代品或辅助品用于某些疾病的治疗， 在肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病及变态反应性疾病等防治方面具有潜在的应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种人白细胞介素29成熟肽第33位赖氨酸定点突变为精氨酸的变 异体（hIL_29L)及其制备方法。 本专利技术提供的技术方案如下： (1)本专利技术的第一方面，提供一种插入了 hIL-29成熟肽第33位赖氨酸定点突变 为精氨酸的变异体编码基因的重组真核表达载体，将本专利技术所述的hIL-29变异体编码基 因 （SEQ ID No:2)与pPIC9KM(源于Invitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请 号为：201110410391.0)重组，获得重组真核表达载体pPIC9K M-hIL-29L，如图1所示；该重 组载体表达产物是肽链中第33位赖氨酸定点突变为精氨酸的hIL-29变异体（SEQ ID No : 1) ;而且，本专利技术将pPIC9KM的α因子中的限制性内切酶Xho I识别位点CTC GAG与蛋白 酶Kex2的识别位点GAG AAA AGA，通过PCR方法引入hIL-29变异体编码基因 （SEQ ID No : 2) 的氨基端，使该重组真核表达载体表达的hIL-29变异体（SEQ ID No: 1)的肽链不会因 引入限制性内切酶位点而增加额外的氨基酸残基。 (2)本专利技术的第二方面，提供一种表达人IL-29变异体的重组酵母工程菌GS115/ hIL-29L，该工程菌是毕赤酵母GS115 (Invitrogen公司）被本专利技术所述的重组真核表达载 体pPIC9KM-hIL-29L转化而获得，且pPIC9K M中的信号肽基因序列与hIL-29变异体的编码 基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可分泌性表达hIL-29变异体至培养 液中。 (3)本专利技术的第三方面，提供一种制备hIL-29变异体成熟肽的方法，该方法包括 以下步骤： ①培养上述重组酵母工程菌，于培养液中添加 I. 5% (v/v)的甲醇作为诱导剂，诱 导重组酵母工程菌分泌表达hIL-29变异体； ②离心培养液去除菌体和不溶物，收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处 理； ③除盐后的培养上清液用强阳离子交换层析柱和凝胶层析柱分离纯化培养液中 的hIL-29变异体，收集含有hIL-29变异体的洗脱液； ④用SDS-PAGE和Western Blot方法分析鉴定纯化的hIL-29变异体。 【附图说明】 图1为重组真核表达质粒pPIC9KM-hIL-29L的构建图谱 图2为IL-29变异体编码基因的PCR扩增结果 图3为重组hIL-29变异体的SDS-PAGE检测结果 图4为重组hIL-29变异体的Western Blot检测结果 【具体实施方式】 以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术的操作方法，这些实施例仅用于详细说 明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。 下述实施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的测定均由上海生工生物工程技 术服务有限公司完成；所用的培养基如无特别说明均按毕赤酵母表达手册（Invitrogen公 司）的配方进行配制。 实施例一突变位点的确定 1、自由结合能的概述 蛋白-蛋白复合物的自由结合能受到多种不同的因素影响，包括蛋白与受体蛋白 间的静电作用和疏水作用。亲合力是由净效应决定的，通过蛋白质工程平衡和优化各能量 项可获得强的结合力。目前，通过对蛋白质进行修饰而获得高亲和力的突变体已成为研究 热点之一。 本专利技术采用波森-波尔兹曼（Poisson-Boltzmann，PB)连续模型进行静电计算以 及通过COMBINE (Comparative Binding Energy)分析，获得系统专一'丨生定量构效关系模型 (QSAR，quantitative structure-activity relati本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术中的重组人白细胞介素‑29变异体(rhIL‑29L)特征在于表达的IL‑29肽链中第33位氨基酸赖氨酸(Lys)经人工定点突变为精氨酸(Arg)，对应于序列表中的SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1. 本发明中的重组人白细胞介素-29变异体（rhIL-29L)特征在于表达的IL-29肽链 中第33位氨基酸赖氨酸（Lys)经人工定点突变为精氨酸（Arg)，对应于序列表中的SEQ ID NO :1。2. 本发明中经人工定点突变改造的人白细胞介素_29变异体的编码基因序列，其特征 在于该序列中第98位碱基由A(腺嘌呤）突变为G(鸟嘌呤），由该碱基组成的三联体密码 由AAG突变为AGG，对应于序列表中的SEQ ID NO :2。3. 本发明中表达重组人白细胞介素_29变异体的重组真核表达载体，其特征在于所述 的重组真核表达载体中插入了权利要求2所述的人白细胞介素-29变异体的编码基因。4. 本发明中的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述的重组毕赤酵母的染色体中整合 有权利要求2所述的人白细胞介素-29变异体的编...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，陆源，李利云，邬敏辰，吴静，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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