本发明专利技术涉及一株能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的蜡样芽孢杆菌菌株NY5(Bacillus cereus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9372。该蜡样芽孢杆菌为好氧型细菌，能够有效抑制罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的生长。通过亚硝酸氮实验去除效率可达到100％。该菌还具有水解酪蛋白和淀粉的功能，并已经通过安全性检测，在水体中蜡样芽孢杆菌NY5浓度为2×107cfu/ml和在注射2.1×106cfu/ml浓度的NY5菌液100μl的条件下，罗非鱼没有出现死亡及其他异常现象。本发明专利技术为有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的生长，及在有氧条件下高效降解亚硝酸盐氮、水解蛋白和淀粉提供了有用的菌源，拓宽了对蜡样芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一株能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的蜡样芽孢杆菌NY5
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高活力蜡样芽孢杆菌菌株NY5 (Bacillus cereus)〇
技术介绍
罗非鱼（Tilapia)隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科（Cichlidae)、罗非鱼属。由于 罗非鱼具有杂食性、生长快、繁殖力强、适应性广等优点，目前已成为世界性主要养殖鱼类。 我国是全球最大的罗非鱼生产国和加工出口国，2013年产量150万吨，加工出国量30多万 吨，出口额10多亿美元。但自2009年以来，我国罗非鱼养殖中病害频繁爆发，损失巨大，严 重影响了罗非鱼产业的可持续发展，其中最为严重的是链球菌病。该病具有传染性强，持续 时间长，死亡率高等特点，成为目前罗非鱼病害防控的难题。 过量的亚硝酸盐氮对水生动物具有一定的毒害作用，因此，养殖水体亚硝酸盐氮 的有效去除是水产业亟待解决的问题之一。 氧气的充足供应是集约化养殖的重要条件之一，而传统的反硝化细菌多数为厌氧 菌，在目前的养殖环境下，其反硝化性能必定受到限制。 集约化水产养殖的水环境是一个特殊的生态系统，大量的饲料投入、饵料残留、动 物排泄物等造成水体有机物浓度迅速升高，导致水体环境的恶化。而芽孢杆菌通常具有非 常强的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶分泌能力，可迅速降解残饵、粪便等大分子物质，降低有机物 累积的同时为其他微生物及藻类提供丰富的营养物质。 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus)广泛存在于土壤等环境中，是一种好氧型的芽 孢杆菌，可产生丰富的蛋白酶、淀粉酶及抑菌物质等。在水产中，将蜡样芽孢杆菌制成微生 态制剂，可以克服使用抗生素所带来的副作用，如鱼体肠道微生态系统失调、免疫力下降、 药物残留及产生抗药性等。蜡样芽孢杆菌能选择性促进生活在肠道的微生物的活性，同时 抑制肠道内有害病菌的生长，降低宿主染病的机会。另外，蜡样芽孢杆菌在生长过程中还会 产生有益的代谢产物，刺激和促进宿主的生长。 针对集约化养殖带来的养殖环境恶化，鱼类抵抗力下降，病害肆虐，滥用抗生素等 问题，筛选出在好氧条件下既能有效的拮抗鱼源链球菌，又能高效降解亚硝酸盐氮、有机物 的蜡样芽孢杆菌，为水产养殖提供新的可用的益生菌菌株。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种能有效抑制罗非鱼源链球菌的生长，能在 有氧条件下高效降解亚硝酸盐氮、水解蛋白和淀粉的蜡样芽孢杆菌NY5。该菌株经过安全性 检测，罗非鱼在蜡样芽孢杆菌NY5浓度为2X 107cfu/ml的水体中及在注射100 μ 1浓度为 2. lX106cfu/ml的ΝΥ5菌液条件下，没有出现死亡及异常情况。该菌株为水产益生菌提供 了有用的菌源，拓宽了对蜡样芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。 本专利技术为解决上述技术问题所采取的技术方案为：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus)NY5,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9372。 蜡样芽孢杆菌NY5的菌落形态为：扁平、无规则、圆形或近似圆形、质地软、无色 素、稍有光泽的、呈白色（似蜡烛样颜色），直径5?7_;需氧，革兰氏阳性芽孢杆菌。最 适生长pH值：5?9,最适生长温度：25-40°C，最适盐度：0_40。 与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果是：该蜡样芽孢杆菌能够有效抑制罗非 鱼源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)的生长。经过反硝化性能培养基培养，结果 表明能在12小时内去除水中的浓度为50mg/L亚硝酸盐氮，去除效率达到100%。其为好氧 芽孢杆菌，可以水解酪蛋白、淀粉，经过安全性检测，发现罗非鱼在蜡样芽孢杆菌NY5浓度 为2X 107cfu/ml的水体中及注射100 μ 1为2. I X 106cfu/ml的NY5菌液，没有出现死亡及 异常情况。本专利技术提供了在有氧条件下高效降解亚硝酸盐氮、水解蛋白和淀粉，并能有效抑 制罗非鱼源无乳链球菌的有用菌源，拓宽了对蜡样芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的 应用价值。 【附图说明】 图1是蜡样芽孢杆菌NY5的16S rRNA基因序列的NJ系统进化树图。 图2是胞外淀粉酶检测结果图。 图3是蛋白酶检测结果图。 【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的描述，当然下述实施例不应理解为对 本专利技术的限制。 一、錯样芽孢杆菌NY5的筛选 (一）材料 1、试验所用样品采集于中国水产科学研究院珠江水产研究所池塘养殖的罗非鱼肠道。 2、培养基： 牛肉膏蛋白胨液体培养基：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0。 牛肉膏蛋白胨固体培养基：在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加琼脂15-20g/L。 牛肉膏蛋白胨高盐培养基：在牛肉膏蛋白胨固体培养基中将NaCl的量增至30g/ L〇 BTB 培养基：天冬酰胺酸 lg/L，KN03lg/L，KH2P04lg/L，FeCl2 · 6H20 0· 05g/L， CaCl2 · 2H20 0· 2g/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，BTB lg/L，琼脂 20g/L，pH 7. 0-7. 2。 反硝化富集培养基：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏5g/L，KN03lg/L。 反硝化培养基（测定性能）：琥珀酸钠 4. 72g/L，NaNO2O. 05g/L，KH2PCM I. 5g/L， Na2HPO4O. 42g/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，pH 7· 2。 酪素培养基：牛肉膏 3g，酪素 8g，琼脂 15g，H2O 1000ml，pH 7. 0-7. 2。 淀粉培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂15g，H2O 1000ml，pH 7· 0-7. 2,所有培养基经 0· llMPa，121°C，灭菌 20min。 3、主要试剂和仪器 革兰氏快速染色液（珠海贝索生物有限公司）， 孔雀绿（广州威佳生物有限公司）， 番红（广州威佳生物有限公司）， API 20E 试剂盒（Biomerieux), API 20Strep 试剂盒（Biomerieux), 细菌DNA提取试剂盒（Omega)， Taq 酶（TaKaRa)， PMD19-T 载体（TaKaRa)， 感受态细胞DH5 a (TaKaRa)， BHI培养基（广州威佳生物有限公司）， 光学显微镜（ZEISS)， PCR 仪（SensoQuest)， 恒温摇床（华利达实验设备有限公司）等。 (二）菌种的分离纯化 将采集的罗非鱼肠道用无菌手术剪剪碎，称取5g样品放入装有45ml无菌水的锥形瓶 中，80°C水浴15min，充分振荡混匀，静止5min，吸取上层液体Iml加入到含有9ml无菌水的 试管中，依次稀释得到不同浓度的菌悬液。分别取IX 1〇_2和IX 1〇_3肠道悬浊液各0. 2ml 滴加到牛肉膏蛋白胨高盐培养基（NaCl 30g/L)固体平板上（每种稀释度3皿），均匀涂布， 将平板置于30°C恒温箱培养1-2天。选取生长良好的单个、不规则、表面粗糙的菌落反复划 线分离进行纯化培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
蜡样芽孢杆菌NY5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9372。
【技术特征摘要】
1. 蜡样芽孢杆菌NY5,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 号为 CGMCC No. 9372。2. 如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌NY5在有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的过程中， 其特征是通过平板扩散法测定NY5菌株的抑制无乳链球菌的应用。3. 如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌NY5在有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的过程中， 其特征是能在有氧条件下高效降解亚硝酸氮方面的应用。4. 如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌NY5在有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的过程中， 其特征是在有氧条件下...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢迈新，刘观斌，王淼，刘志刚，可小丽，高风英，曹建萌，朱华平，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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