一种香蕉多酚氧化酶基因、重组蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种香蕉多酚氧化酶基因、重组蛋白及其制备方法，该制备方法按照以下步骤实施：提取香蕉果肉的总RNA并进行反转录，利用电子克隆的方法得到香蕉PPO的编码区序列，构建含有PPO的重组质粒pQE 80L-PPO，将获得的重组质粒pQE 80L-PPO加入到大肠杆菌M15感受态细胞中得到香蕉PPO表达菌pQE 80L-PPO/M15；培养并纯化得到香蕉PPO重组蛋白；该方法具有技术简单、成本低、操作快速、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白易于纯化和具有生物学活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种香蕉多酚氧化酶基因，本专利技术还涉 及一种香蕉多酚氧化酶的重组蛋白，本专利技术还涉及一种香蕉多酚氧化酶的重组蛋白的制备 方法。
技术介绍
国内外对香蕉多酚氧化酶（PPO)基因的研究非常有限。美国专利公布了一种分 离香蕉PPO的核酸及其片段和衍生物的方法（Robinson，1998)。威廉斯蕉四种不同的PPO cDNA 片段 BPOI (906bp)，BPOII (901bp)，BP034 (925bp)和 BP035 (960bp)被扩增出来，并 且用特异性引物扩增得到BP0I2078bp的全长基因，该基因含有一个85bp的内含子，富含 58% AT，但该PPO序列却未在NCBI等数据库中登陆。四种PPO cDNA在生长期和成熟期不 同组织中的表达状况表明，香蕉PPO在果实生长早期合成，在成熟的过程中被释放。Grand Nain香蕉PPO基因部分序列被扩增得大，该基因编码141个氨基酸。Gros Michel香蕉在 42 °C 15min处理后4°C储存延缓了香蕉果皮褐变，分析PPO基因的表达量发现，这与热处理 后编码香蕉PPO mRNA的表达量减少，导致酶活性降低有关。AAA和AA基因型香蕉果肉和果 皮PPO的褐变速率高于AAB和ABB基因型的。 传统克隆新基因的方法是采用克隆原位杂交筛选cDNA文库或是利用基因特异 性引物进行cDNA末端快速扩增，其特点是花费高、耗时、成功率低。电子克隆（in Silico cloning)是近几年来伴随着EST (Expressed sequence tags)计划发展起来的一种基于计 算机分析的克隆基因的新方法。1994年美国Boguski开始利用电子克隆方法发现新基因， 中国科学院生物物理研究陈润生课题组于1996年也开始了对电子克隆的研究（陈润生， 1999)。 1975年建立的细胞融合技术使得真核生物基因在原核生物中进行表达成为可能， 从而可以获得自然界无法大量获得的多肽和蛋白质。大肠杆菌是首个用于重组蛋白表达的 宿主菌，它具有遗传背景清楚、生长繁殖快、培养操作简单、成本低廉和表达外源基因产物 的水平高等特点。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 大肠杆菌表达系统主要由宿主菌、表达载体和外源基因构成。当前，应用的最广泛 的原核表达载体主要是PET载体和PQE载体。pET系统是目前在E. coli中克隆表达重组蛋 白最强大的系统，它是最初利用与启动子配套的能高效转录特定基因的外源RNA聚合酶， 构建的T7RNA聚合酶/启动子系统，目的基因被克隆到pET质粒载体上，转入宿主菌，经过 诱导表达可以生产大量的目的蛋白。人们运用基因工程技术已在PET系统中成功地表达了 多酚氧化酶、漆酶、蔗糖磷酸化酶、酪氨酸酶、人胸腺素 β 4二串体蛋白、碳青霉烯酶、骨形 态发生蛋白-2等蛋白。 多酚氧化酶是酶促合成茶黄素反应的关键酶。茶黄素具有极强的抗氧化、抗肿瘤、 降血脂、抗菌杀菌和消除自由基等药理功能。其也是红茶滋味和汤色的主要品质成分，红茶 汤色的亮和滋味的鲜爽度等都与茶黄素的含量有密切的关系。多酚氧化酶还可以应用 于红茶香气和品质的改善，以及茶饮料稳定性的改善。多酚氧化酶催化蛋白质形成分子内 或分子间交联，可改善蛋白质的热稳定性、乳化性、凝胶特性、保水性和流变学特性等功能 特性。也可导致蛋白质过敏原性的降低，甚至完全消除。随着人们对多酚氧化酶新功能的 不断挖掘，多酚氧化酶在食品领域必定有着广泛的应用。但是由于PPO在自然界含量较低， 在分离纯化过程中易变性失活，且分离纯化步骤繁琐，得率低，因此制约了其在茶黄素酶法 合成、蛋白交联等食品领域中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种香蕉多酚氧化酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其 氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 本专利技术的另一目的是提供一种上述的香蕉多酚氧化酶的重组蛋白，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 3 所示。 本专利技术的另一目的是提供一种香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，旨在利用大 肠杆菌易培养、繁殖快、易诱导、在短时间内能廉价地大量生产所需酶类的特点，应用基因 工程技术，克隆香蕉PPO基因，构建表达工程菌，获得工程蛋白酶，拓宽工业用多酚氧化酶 的渠道。 本专利技术所采用的技术方案是，一种香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，具体按 照以下步骤实施： 步骤1、提取香蕉果肉的总RNA并进行反转录，得到反转录的CDNA ; 步骤2、利用电子克隆的方法得到香蕉PPO的编码区序列，并进行PCR扩增验证，得 到香蕉PPO的编码区序列； 步骤3、构建含有步骤2的PPO的编码区序列的重组质粒pQE80L-PP0 ; 步骤4、将步骤3获得的重组质粒pQE80L-PP0加入到大肠杆菌M15感受态细胞中， 于冰上放置30min后于42°C水浴热击90s ;加入无抗生素的LB培养基中培养Ih后涂布于含 氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板，37°C条件下培养过夜，得到香蕉PPO表达菌PQE80L-PP0/ M15 ； 步骤5、培养香蕉PPO表达菌pQE80L-PP0/M15,使用IPTG诱导香蕉ΡΡ0,产生香蕉 PPO重组蛋白，其中IPTG诱导条件为IPTG浓度0.6mM，诱导时间为6h ; 步骤6、纯化香蕉PPO重组蛋白，得到香蕉PPO重组蛋白，所述香蕉PPO重组蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。 进一步地，步骤1中香蕉果肉的总RNA的提取具体按照以下步骤实施： 提取缓冲液内含2% CTAB、pH9. 0、100mM Tris-硼酸、I. 4M NaCl、pH8. 0、20mM EDTA 和2%PVP-K30,用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，将其预热至60°C ;果肉用液氮速 冻后研磨成粉末，每〇. 2g果肉加入ImL提取缓冲液，涡旋混匀，于60°C放置30min，每隔 5-10min颠倒混匀1次；向提取混合液中添加0. 5M CaC12使其摩尔浓度为lOOmM，25°C放 置20min;冷至室温，用等体积的氯仿：异戊醇（24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000r/ min离心5min;取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1)抽提，混匀，静置分层，室温 12000r/min离心5min ;上清液加10M LiCl至终浓度为3M，-20°C中放置12h，4°C下12000r/ min离心20min ;小心倒掉上清，沉淀用0. 5mL3M LiCl洗漆至少3次；沉淀用0. 3mL DEPC 水溶解，再用等体积的水饱和酚，氯仿顺序抽提；吸取上清液，加入1/15体积的pH5. 2、3M NaAc和1/5体积无水乙醇，冰上放置0. 5h，4°C下以12000r/min离心20min ;上清液加1/10 体积3M NaAc (pH5. 2)和3倍体积无水乙醇放在-70冰箱里沉淀2h，4°C下12000r/min离心 20min，沉淀物用0. 5mL75%乙醇洗涤2次，0. 5mL无水乙醇洗涤一次，每次都经12000r/min 离心lmin，室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香蕉多酚氧化酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1. 一种香蕉多酚氧化酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。2. -种如权利要求1所述的香蕉多酚氧化酶的重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 3 所示。3. -种香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施： 步骤1、提取香蕉果肉的总RNA并进行反转录，得到反转录的cDNA ; 步骤2、利用电子克隆的方法得到香蕉PP0的编码区序列，并进行PCR扩增验证，得到香 蕉PP0的编码区序列； 步骤3、构建含有步骤2的PP0的编码区序列的重组质粒pQE80L-PP0 ; 步骤4、将步骤3获得的重组质粒pQE80L-PP0加入到大肠杆菌M15感受态细胞中，于 冰上放置30min后于42°C水浴热击90s ;加入无抗生素的LB培养基中培养lh后涂布于含 氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板，37°C条件下培养过夜，得到香蕉PP0表达菌PQE80L-PP0/ M15 ； 步骤5、培养香蕉PP0表达菌pQE80L-PP0/M15,使用IPTG诱导香蕉PP0,产生香蕉PP0 重组蛋白，其中IPTG诱导条件为IPTG浓度0. 6mM，诱导时间为6h ; 步骤6、纯化香蕉PP0重组蛋白，得到香蕉PP0重组蛋白，所述香蕉PP0重组蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 3所示。4. 根据权利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步 骤1中香蕉果肉的总RNA的提取具体按照以下步骤实施： 提取缓冲液内含 2% CTAB、pH9. 0、100mM Tris-硼酸、1.4M NaCl、pH8. 0、20mM EDTA 和 2% PVP-K30,用前加入0 -巯基乙醇至终浓度为2%，将其预热至60°C ;果肉用液氮速冻后 研磨成粉末，每〇. 2g果肉加入lmL提取缓冲液，润旋混勻，于60°C放置30min，每隔5-10min 颠倒混匀1次；向提取混合液中添加0. 5M CaC12使其摩尔浓度为100mM，25°C放置20min ; 冷至室温，用等体积的氯仿：异戊醇（24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000r/min离心 5min ;取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000r/min 离心5min ;上清液加lOMLiCl至终浓度为3M，-20°C中放置12h，4°C下12000r/min离心 20min ;小心倒掉上清，沉淀用0. 5mL3MLiCl洗涤至少3次；沉淀用0. 3mL DEPC水溶解， 再用等体积的水饱和酚，氯仿顺序抽提；吸取上清液，加入1/15体积的pH5. 2、3MNaAc和 1/5体积无水乙醇，冰上放置0. 5h，4°C下以12000r/min离心20min ;上清液加1/10体积 3MNaAc(pH5. 2)和3倍体积无水乙醇放...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁德保，李奕星，李芬芳，王朝政，周娅，金志强，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院海口实验站，
类型：发明
国别省市：海南;66