一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法技术

本发明专利技术涉及一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，包括以下步骤：将皖贝母生长期鳞茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈伤组织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织；其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。本发明专利技术所提供的方法简单易行，缩短了愈伤组织诱导的周期，提高了诱导成功率，出愈率为70-83.33％，胚性愈伤率为80.95-84％；并且，依照本发明专利技术所提供的诱导增殖方法获得的愈伤组织具有更好的质量和发育成苗的性能。

【技术实现步骤摘要】
-种晓贝母愈伤组织诱导增殖方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体的涉及一种晚贝母愈伤组织诱导增殖方 法。
技术介绍
晚贝母（F. anhuiensis)是百合科(Xiliaceae)贝母属（Rritillaria L.)的一种 多年生球根植物，具有较高的药用价值和观赏价值。自然分布于安徽省大别山区和江淮丘 陵区，适应范围较小，并且它喜欢冷凉的气候，喜湿润±壤，但怕积水，当温度超过3(TC后， 地上部分便会枯萎。目前多在安徽金寨、舒城、霍山一带进行栽培种植，但它作为一种常用 药材，需求量大，因此长期处于供不应求的状态。 晚贝母常规的繁殖方法W播种和分球繁殖为主，用鱗茎进行繁殖，其繁殖系数低， 且长期进行无性繁殖，容易造成种性退化，抗性降低，生长速度缓慢或出现变色、坏死、崎形 等不健康状态。而用种子进行有性繁殖，繁殖周期长，一般要4-5年的时间才能长成开花种 球，很难适应和满足产业化大生产和国内外市场的需求。而通过组织培养可W克服鱗茎繁 殖和有性繁殖技术上的缺点，并且不受外界环境条件的限制，可W大大加快其繁殖速度，缩 短育种年限，满足现代大规模生产的需要。 目前，关于贝母组织培养已有一些研究，并取得了一定的进展，该些研究多采用贝 母的鱗茎作为外植体，通过离体培养进行愈伤的诱导，或进行鱗茎的再生等W达到快速繁 殖的目的，已经在川贝母、平贝母、伊贝母、暗紫贝母等种类上取得了很好的效果。而目前关 于晚贝母组培的研究较少，基于各种贝母种间存在差异，不同的贝母由于其生长特性的差 异在进行愈伤组织诱导时所适用的诱导方式也有一定的差异，当将现有的贝母组织培养技 术应用于晚贝母的愈伤组织诱导时，诱导效果不理想。因此需要提供一种操作过程简单易 行、诱导成功率高的适用于晚贝母愈伤组织诱导的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适用于晚贝母愈伤组织诱导增殖的方法，从而简化晚 贝母愈伤组织诱导的操作过程，提高晚贝母愈伤组织的诱导成功率。 为达到W上目的，本专利技术提供了一种晚贝母愈伤组织诱导增殖方法，所述方法包 括W下步骤： 将晚贝母生长期鱗茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈 伤组织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织； 其中，所述诱导培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。 可选的，所述诱导增殖的步骤包括： 1)利用诱导培养基在19-2rc的培养温度下，黑暗培养14-16天； 2)黑暗培养结束后转移至光照强度为900-11001X、光照时间为9-1比八1、培养温 度为19-2rc的条件下培养32-36天获得愈伤组织。 3)将愈伤组织接种于增殖培养基中，在光照强度为1500-20001X、光照时间为 9-1比八1、培养温度为19-2rc的条件下培养38-42天进行增殖扩繁获得致密愈伤组织。 可选的，所述诱导培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5-2. Omg/L 的 6-BA，浓度为 0. 2-4. Omg/L 的 NAA。 可选的，所述增殖培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有浓度为0. 5-2. Omg/L 的6-BA，浓度为0. 2-2. Omg/L的NAA，浓度为50-300mg/L的水解乳蛋白。 可选的，所述诱导培养基还含有浓度为30-35g/L的藏糖，浓度为6. 5-7. Og/L的琼 脂。 可选的，所述增殖培养基还含有浓度为50-60g/L的藏糖，浓度为6. 5-7. Og/L的琼 脂。 可选的，所述诱导培养基和增殖培养基的pH为5. 8-6. 0。 可选的，所述消毒的步骤包括： 将清洗干净的鱗茎在75%的酒精中表面消毒50-70S后用无菌水清洗2-3次，再将 鱗茎在0. 1%的升隶溶液中浸泡8-12min后用2%的次氯酸轴水溶液浸泡12-16min。 本专利技术所提供的方法简单易行，缩短了愈伤组织诱导的周期，提高了诱导成功率， 出愈率为70-83. 33%，胚性愈伤率为80. 95-84%;并且，依照本专利技术所提供的诱导增殖方法 获得的愈伤组织具有更好的质量和发育成苗的性能。 【附图说明】 图1为晚贝母生长期鱗茎切块刚接种到诱导培养基中的情况； 图2为经过黑暗培养后移至光照条件下培养10天左右鱗茎切块开始膨大的情 况； 图3为膨大的鱗茎切块形成的愈伤组织； 图4为增殖培养后获得的致密愈伤组织。 【具体实施方式】 [00巧]下面将通过【具体实施方式】对本专利技术进行详细说明。 本专利技术提供了一种晚贝母愈伤组织诱导增殖方法，所述方法包括W下步骤： 将晚贝母生长期鱗茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈 伤组织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织；其中，所述诱导培养基为：W MS培 养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。 在本专利技术中，所述生长期鱗茎采自处于营养生长期的晚贝母种球，即地上部分开 始长叶至有花蕾前，一般的，营养生长期的鱗茎处于细胞生长胚盛时期，可W用作外植体用 于诱导获得结构致密的愈伤组织。 本专利技术所提供的方法还包括在进行消毒前的清洗步骤，本专利技术对于清洗的方法 没有特别的限制，只要能够去除杂物获得洁净的鱗茎即可，在本专利技术的一种实施方式中， 可W先剥除晚贝母鱗茎上带有的老鱗茎及根等杂物，然后将鱗茎置于有洗洁精的溶液中 浸泡15-25min，浸泡期间不停的摇晃W脱除鱗茎表面的杂物，之后用流动清水冲洗鱗茎 60-90min获得清洗干净的鱗茎。 根据本专利技术所提供的方法，所述消毒的步骤包括： 将清洗干净的鱗茎在75%的酒精中表面消毒50-70S后用无菌水清洗2-3次，再将 鱗茎在〇.1%的升隶溶液中浸泡8-121111]1后用2%的次氯酸轴水溶液浸泡12-161]11]1。在用 次氯酸轴溶液浸泡后，还需要用无菌水对鱗茎清洗3-5次，每次3-5min，清洗结束后，用无 菌滤纸吸干鱗茎表面的水分。为了避免杂菌污染，上述步骤需要在超净工作台中进行。 在诱导前，将鱗茎切割成小方块，所述小方块的尺寸约为5mmX5mmX3mm。 在本专利技术所提供的方法中，所述诱导培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有 浓度为 0. 5-2. Omg/L 的 6-BA，浓度为 0. 2-4. Omg/L 的 NAA。 为了获得更好的诱导效果，提高愈伤组织的诱导率、使愈伤组织的质地更坚实。优 选的，所述诱导培养基为：W MS培养基为基本培养基，含有浓度为2. Omg/L的6-BA，浓度 为0. 5mg/L的NAA，或者，W MS培养基为基本培养基，含有浓度为0. 5mg/L的6-BA，浓度为 4. Omg/L 的 NAA。 在本专利技术所提供的方法中，所述增殖培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有 浓度为0. 5-2. Omg/L的6-BA，浓度为0. 2-2. Omg/L的NAA，浓度为50-300mg/L的水解乳蛋 白。 优选的，为了获得更好的增殖效果，所述增殖培养基为；W MS培养基为基本培养 基，含有浓度为2. Omg/L的6-BA，浓度为0. 5mg/L的NAA，浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：将皖贝母生长期鳞茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈伤组织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织；其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6‑BA和NAA。

【技术特征摘要】
1. 一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤： 将皖贝母生长期鳞茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈伤组 织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织； 其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。2. 根据权利要求1所述的皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导增殖 的步骤包括： 1) 利用诱导培养基在19_21°C的培养温度下，黑暗培养14-16天； 2) 黑暗培养结束后转移至光照强度为900-llOOlx、光照时间为9-llh/d、培养温度为 19-21°C的条件下培养32-36天获得愈伤组织； 3) 将愈伤组织接种于增殖培养基中，在光照强度为1500-20001X、光照时间为9-llh/ d、培养温度为19-21°C的条件下培养38-42天进行增殖扩繁获得致密愈伤组织。3. 根据权利要求1或2所述的皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导培 养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0. 5-2. Omg/L的6-BA，浓度为0. 2-4. Omg/ L 的 NA...

【专利技术属性】
技术研发人员：于晓南，郝丽红，程堂仁，张启翔，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11