一种吸水链霉菌的诱变方法技术

本发明专利技术公开一种吸水链霉菌的诱变方法，将吸水链霉菌新鲜斜面用甘油与吐温80洗下，过滤，将过滤后的单孢子原液加水，加入灭菌的LiCl水溶液，在摇床作用6小时后立即取出，置于紫外灯下照射；紫外光光照射处理后，孢子液于4℃避光放置，转入可见光下，稀释涂布于LiCl的分离培养基平皿上，25℃培养；将在分离培养基平皿上的单菌落接种在葡萄糖天门冬素培养基上培养；再经过种子培养基培养、液体发酵培养基发酵。本发明专利技术利用紫外光处理、光复活和暗修复等方法中菌体效价与发酵上清液效价呈中等程度以上的正相关性，提高菌株的变异几率。在这种情况下可以用测定发酵上清液效价取代测定菌体效价来进行初筛工作，以排除大量低产型菌落。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物领域，具体涉及吸水链霉菌的诱变方法。
技术介绍
雷帕霉素(Rapamycin，RPM, RAPA)，又名西罗莫司(Sirolimus)，是在1975年由加拿大Ayerst研究所从吸水链霉菌(Strepomyces hygroscopicus)中分离出来的三烯大环内酯类抗生素，它作为一种新型的高效免疫抑制剂引起了广泛的关注，同时它又是一种有效的抗真菌剂并具有抗肿瘤的作用。进行大规模发酵和工业化生产，菌种选育最重要的手段之一。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术目的在于提供一种选育吸水链霉菌的方法。 为解决以上技术问题，本专利技术提供的技术方案是，提供，步骤如下: I)将吸水链霉菌新鲜斜面用20%甘油与0.1%吐温80洗下，过滤，将过滤后的单孢子原液加水至10ml，按0.85%终浓度加入灭菌的LiCl水溶液，在28°C摇床作用6小时后立即取出，置于波长253.7nm、功率30W的紫外灯下30cm处开盖振摇照射；紫外光光照射处理后，孢子液于4°C避光放置24h，转入可见光下，稀释涂布于0.5 % LiCl的分离培养基平皿上，于25°C培养20天； 2)将在分离培养基平皿上长好的单菌落接种在葡萄糖天门冬素培养基斜面上，于25°C培养15天后进行液体发酵； 3)于250ml三角瓶内装50ml种子培养基，由斜面按种后于28°C振摇培养48小时； 4)于500ml三角瓶内装50_100ml液体发酵培养基，由种子以5%接种量转种后于25°C振摇培养96小时，结束发酵。 进一步地，所述分离培养基组分及重量百分比为酵母膏0.1 %、牛肉膏0.1 %，水解乳蛋白0.2%、葡萄糖1.0%，琼脂1.2%。 进一步地，所述葡萄糖天门冬素培养基组分及重量百分比为:天门冬素0.05%，K2HPO40.05%，葡萄糖 1.0%，琼脂 1.2%0 [0011 ] 进一步地，所述种子培养基组分及重量百分比为:黄豆饼粉2.0%，葡萄糖2.5%，淀粉 1.0%, (NH4)2S040.3%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，CaCO30.2%。 进一步地，所述液体发酵培养基组分及重量百分比为:黄豆饼粉3.0%，葡萄糖2.5%, (NH4)2S040.5%，ΚΗ2Ρ040.3%，CaCO30.3%，液化淀粉 2.0%,消沫剂:0.02%，豆油:0.5%, pH 8.0。 与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点: 本专利技术利用紫外光处理、光复活和暗修复等方法中菌体效价与发酵上清液效价呈中等程度以上的正相关性，提高菌株的变异几率。在这种情况下可以用测定发酵上清液效价取代测定菌体效价来进行初筛工作，以排除大量低产型菌落。 【具体实施方式】 将吸水链霉菌新鲜斜面用20%甘油与0.1%吐温80洗下，过滤，将过滤后的单孢子原液加水至10ml，按0.85%终浓度加入灭菌的LiCl水溶液，在28°C摇床作用6小时后立即取出，置于波长253.7nm、功率30W的紫外灯下30cm处开盖振摇照射；紫外光光照射处理后，孢子液于4°C避光放置24h，转入可见光下，稀释涂布于0.5% LiCl的分离培养基平皿上，于25°C培养20天。分离培养基组分及重量百分比为酵母膏0.1%、牛肉膏0.1%，水解乳蛋白0.2%、葡萄糖1.0%，琼脂1.2%。 将在分离培养基平皿上长好的单菌落接种在葡萄糖天门冬素培养基斜面上，于25°C培养15天后进行液体发酵。葡萄糖天门冬素培养基组分及重量百分比为:天门冬素0.05%, K2HPO40.05%，葡萄糖 1.0%，琼脂 1.2% 0 于250ml三角瓶内装50ml种子培养基，由斜面按种后于28 °C振摇培养48小时；种子培养基组分及重量百分比为:黄豆饼粉2.0%，葡萄糖2.5%，淀粉1.0%，(NH4) 2S040.3 %，KH2PO40.05 %，MgSO40.05 %，CaCO30.2 %。 于500ml三角瓶内装50_100ml液体发酵培养基，由种子以5 %接种量转种后于25°C振摇培养96小时，结束发酵。液体发酵培养基组分及重量百分比为:黄豆饼粉3.0%，葡萄糖 2.5%，(NH4)2SO40.5%, KH2P04 0.3 %, CaCO3 0.3 %，液化淀粉 2.0 %，消沫剂:0.02%，豆油:0.5%, pH 8.0。 菌液分析: 雷帕霉素的TLC分析:发酵液离心后菌丝用三倍体积的95%乙醇浸泡2— 3小时，在硅胶板上点样，用丙酮:正已烷2:3展开，溶媒挥发后在含白色念珠菌检定平板上铺板显迹。用雷帕霉素标准品作为对照。 波拉霉素(po1ramycin)的TLC分析:发酵液离心后菌丝加95 %乙醇至原体积，浸泡2— 3小时，在硅胶板上点样。用异丁醇:水4:1展开，溶媒挥发后在含枯草杆菌检定平板上铺板显迹。用波拉霉素粗品作为对照。 HPLC 分析:用岛津 Lc 一 6A, Shirnadzu shim-pack ODS 柱,检测波长为 277nm,流动相80%甲醇,流速lml/min。 还原糖的测定:蒽酮比色定糖法。 氨基氮的测定:甲醛法。 发酵液总蛋白含量的测定=Folin-酚法。 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性检测:于不同时间分别取发酵液10ml，离心，弃上清，将菌体用0.9 % NaCl溶液洗两次后，加入柠檬酸-Na2HPO4缓冲液5ml，混匀，冰浴中超声波破碎8分钟(10HZ，100W)，取出，4°C 12000rpm离心20min，上清即为粗酶液(稀释后即可由Folin-酚法测定其总蛋白浓度)。将不同溶液按以下比例加入:0.58mlH20，0.1OmlNADP-Na2 溶液，0.1OmlTris-HCI 缓冲液，0.1OmlMgCl2 溶液，0.1Oml G_6-P_Na2溶液，0.02ml粗酶液。加好后混匀，移入石英比色杯中，记下339nm的光吸收值。室温(250C )反应,2.3min后开始读数。每隔一分钟读一次,连续读3_5min,取平均值,据b =8095 X ΛΑ/At(U/L)计算酶活力。由酶活力除以相应粗酶液的总蛋白浓度即知其相对活力。 菌丝干重的测定:于不同时间取定量发酵液，离心，弃上清，用无菌水洗两次，置80 一 100°C烤干至恒重。 本专利技术利用紫外光处理、光复活和暗修复等方法中菌体效价与发酵上清液效价呈中等程度以上的正相关性，提高菌株的变异几率。在这种情况下可以用测定发酵上清液效价取代测定菌体效价来进行初筛工作，以排除大量低产型菌落。 以上仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本专利技术的限制，本专利技术的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种吸水链霉菌的诱变方法，其特征在于，步骤如下：1)将吸水链霉菌新鲜斜面用20％甘油与0.1％吐温80洗下，过滤，将过滤后的单孢子原液加水至10ml，按0.85％终浓度加入灭菌的LiCl水溶液，在28℃摇床作用6小时后立即取出，置于波长253.7nm、功率30W的紫外灯下30cm处开盖振摇照射；紫外光光照射处理后，孢子液于4℃避光放置24h，转入可见光下，稀释涂布于0.5％LiCl的分离培养基平皿上，于25℃培养20天；2)将在分离培养基平皿上长好的单菌落接种在葡萄糖天门冬素培养基斜面上，于25℃培养15天后进行液体发酵；3)于250ml三角瓶内装50m1种子培养基，由斜面按种后于28℃振摇培养48小时；4)于500ml三角瓶内装50‑100ml液体发酵培养基，由种子以5％接种量转种后于25℃振摇培养96小时，结束发酵。

【技术特征摘要】
1.一种吸水链霉菌的诱变方法，其特征在于，步骤如下: 1)将吸水链霉菌新鲜斜面用20%甘油与0.1%吐温80洗下，过滤，将过滤后的单孢子原液加水至10ml，按0.85%终浓度加入灭菌的LiCl水溶液，在28°C摇床作用6小时后立即取出，置于波长253.7nm、功率30W的紫外灯下30cm处开盖振摇照射；紫外光光照射处理后，孢子液于4°C避光放置24h，转入可见光下，稀释涂布于0.5% LiCl的分离培养基平皿上，于25°C培养20天； 2)将在分离培养基平皿上长好的单菌落接种在葡萄糖天门冬素培养基斜面上，于25°C培养15天后进行液体发酵； 3)于250ml三角瓶内装50ml种子培养基，由斜面按种后于28°C振摇培养48小时； 4)于500ml三角瓶内装50-100ml液体发酵培养基，由种子以5%接种量转种后于25°C振摇培养96小时，结束发酵。2.根据权利要求1所述的利用吸水链霉菌生产雷帕霉素的方法，其特征在于，所述分离培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：金京勋，
申请(专利权)人：苏州嘉禧萝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32