本发明专利技术公开了一种纤维素酶重组乳酸杆菌表达载体及其构建方法。主要包括以下内容:①将SEQNO.1所示纤维素酶基因克隆到乳酸杆菌表达载体上，构建纤维素酶基因重组表达载体；②将重组表达载体转化乳酸杆菌，使乳酸杆菌能表达纤维素酶，获得纤维素酶重组乳酸杆菌。该重组乳酸杆菌饲喂家畜后既能培养消化道优势益生菌群，又能提高日粮纤维素的分解效率，从而节约家畜饲养成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
纤维素类物质是一类在自然界中存在的最丰富、最廉价的可再生资源。由于纤维 素类物质结构致密，动物食用后消化利用率非常低。因此，提高动物对纤维素类物质的消化 利用率，一直是人们努力研究的方向，应用纤维素酶便是重要的手段之一。 纤维素酶（Cellulase)是把纤维素降解成葡萄糖的一组酶的总称。可将其分类 为三大类：内切β-1，4-葡聚糖酶、外切β-1，4-葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。3种酶协 同作用，完成对纤维素的降解。纤维素酶广泛存在于微生物中，人们已经从40多种细菌和 数种真菌中克隆到了纤维素酶基因，有近100多个纤维素酶基因可在大肠杆菌中克隆和表 达（Singhania RR, Sukumaran RK, Pandey A. Improved cellulase production by Trichoderma reesei RUT C30 under SSF through process optimization [J]. Appl Biochem Biotechnol，2007，142 (1): 60-70)。目前，纤维素酶主要作为酶制剂添加到 动物饲料中，存在的主要问题是在饲料加工调制过程中酶的损失严重，酶自身的活性不 高，或者在进入动物消化道时容易经被蛋白酶分解而失去了原有酶活性。将纤维素酶基 因在动物的体内进行高效表达则可以明显地避免这些不足，但是目前要想实现外源基因 在动物器官或细胞中的表达，还有一定的难度。因此，将外源基因在动物消化道优势菌群 中进行表达，不失为一个理想的方法（Yu B, Liu J R, Hsiao F S, et al. Evaluation of Lactobacillus reuteri Pg4 strain expressing heterologous [beta]-glucanase as a probiotic in poultry diets based on barley [J]. Animal Feed Science and Technology, 2008, 141 (1-2): 82-91)。纤维素酶基因目前已在大肠杆菌中实现表达，但 是大肠杆菌为条件致病菌，过量在动物消化道繁殖会引发疾病。 乳酸杆菌是一类分解糖类产生乳酸的厌氧、兼性厌氧无芽孢革兰氏阳性菌 (Vincent J G, Veomett R C, Riley R F. Antibacterial activity associated with Lactobacillus acidophilus [J]· J Bacteriol, 1959, 78: 477-484)，它可以产生乳酸 菌素，通过生物拮抗作用，改善动物肠道的生态环境，从而提高动物的免疫力。此外乳酸杆 菌还具有外分泌性强和发酵性能良好等特点，目前已相继开发出了乳酸杆菌的克隆载体、 表达载体、整合载体，并在试验和生产上得到广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，构建 的纤维素酶重组乳酸杆菌表达载体，可将纤维素酶基因在乳酸杆菌中进行表达。 本专利技术目的是通过以下技术方案实现的： 本专利技术首先提供了一种纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ NO. 1所示。 其次，本专利技术提供了一种纤维素酶重组乳酸杆菌表达载体，该载体包含所述的纤 维素酶基因。 所述纤维素酶重组乳酸杆菌表达载体的构建方法，包括以下步骤：用限制性内切 酶双酶切乳酸杆菌表达载体和所述纤维素酶基因后，将所述纤维素酶基因克隆到乳酸杆菌 表达载体中。 所述乳酸杆菌表达载体为PLEM415。 本专利技术还提供了一种纤维素酶重组乳酸杆菌，通过构建纤维素酶重组乳酸杆菌表 达载体，将该表达载体电转化宿主乳酸杆菌，通过红霉素抗性培养基筛选，获得表达纤维素 酶基因的重组乳酸杆菌。 所述宿主乳酸杆菌为乳杆菌(ZacioAaciBw1S 5/7. )P1，已于2014年10月22日在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 9832,保 藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 本专利技术的优点和积极效果： 本专利技术的优点在于构建的纤维素酶重组乳酸杆菌表达载体，可将野生中华竹鼠结肠细 菌来源的纤维素酶基因在乳酸杆菌中进行表达。用该纤维素酶重组乳酸杆菌饲喂家畜后既 能利用乳酸杆菌提高动物免疫力，又能利用纤维素酶提高日粮纤维素的分解效率，从而节 约家畜饲养成本。 【附图说明】 图1是构建pLEM-Cel载体示意图； 图2是pLEM-Cel载体转化乳酸杆菌后，经红霉素抗性MRS培养基筛选后，提取乳酸杆 菌基因组DNA，纤维素酶基因 PCR扩增结果；M为TakaRa公司DL 2000 DNA Ladder。1为红 霉素抗性筛选后阳性细胞纤维素酶扩增结果。 【具体实施方式】 实施例I :pLEM_Cel载体构建 以野生中华竹鼠结肠分离获得的克雷伯杆菌基因组DNA为模板，参照GenBank报道的 该细菌纤维素酶基因 Cel (登录号：CP001891.1)序列设计引物，并在引物两端加上保护碱 基并带上分el和油a I酶切位点，引物序列为： Cel-F CACTACTAGTATGCCCCTGCGTGCTTTAG Cel-R CTGCTCTAGACTAACGCTGATCCTGTTTCG 在25μ1反应体系中PCR扩增纤维素酶Cel基因序列，反应条件为95°C预变性5min， 95°C /30sec，58°C /30sec，72°C /lmin,反应 35 个循环，再 72°C延长 lOmin。PCR 产物纯化 后分别用I和I双酶切，pLEM415质粒分别用分el和I双酶切，酶切产物回收后 用T4 DNA连接酶连接，构建成pLEM-Cel载体（图1)。 实施例2 :纤维素酶重组乳酸杆菌的筛选 在获得纤维素酶重组乳酸杆菌前，用野生中华竹鼠结肠分离获得的明串珠乳酸杆菌 (乳杆菌(Zettacoflo1SiocAaciJrJrW1S 5/7. )P1，于2014年10月22日在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 9832)制备乳酸杆菌感受态细胞。 具体制备步骤为：①挑取明串珠单菌落接种至5mL MRS液体培养基，37°C过夜培养培养； ②按1:50的比例扩大培养，接种至MRS培养基(含I. 2%甘氨酸)，37°C至OD=O. 6 ;③取出培 养液，冰浴10 min,4°C 6000g离心IOmin;④无菌条件下弃上清，用预冷的灭菌双蒸水漆 液菌体2次；⑤4° C 6000g离心5min，弃上清，用预冷的10%甘油重悬菌体，4° C 6000g 离心5min收集菌体；⑥重复步骤⑤操作；⑦预冷的1/100原体积的洗涤液重悬菌体，分装 小管，每管5〇μ?，储存于-80°C备用。 乳酸杆菌感受态细胞制备好以后，用质粒PLEM-Cel进行乳酸杆菌电转化和红霉 素抗性筛选。具体步骤为：①将2PL质粒pLEM-Cel加于5〇μ?乳酸杆菌感受态细胞中混合 均匀，转移至0. 2cm无菌4°C预冷的电击杯中；②用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
【技术特征摘要】
1. 一种纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ NO. 1所示。2. -种纤维素酶重组乳酸杆菌表达载体，该载体包含权利要求1所述的纤维素酶基 因。3. 如权利要求2所述的纤维素酶重组乳酸杆菌表达载体的构建方法，其特征在于：包 括以下步骤：用同样的限制性内切酶双酶切乳酸杆菌表达载体和所述纤维素酶基因后，将 所述纤维素酶基因克隆到乳酸杆菌表达载体中。4. 根据权利要求3所述的纤维素酶重组乳酸杆菌表达载体的构建方法，其特征在于： 所述乳酸杆菌表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：白丁平，黄小红，黄一帆，张伟妮，于学荣，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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