一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法技术

本发明专利技术涉及一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法：a）PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA：以甲基化环状DNA为模板，使用带突变位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增；b）将步骤a）的PCR产物使用限制性内切酶DpnI消化，去除甲基化模板；c）将步骤b）中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。本发明专利技术的方法可实现一步多点突变，且操作简单，突变率高，单点突变阳性率95%以上，相距1kb以上两点、三点突变阳性率在60%以上。

【技术实现步骤摘要】
-种基于甲基化环状DNA分子的突变方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体地说，涉及一种基于甲基化环状DNA分子 的突变方法。
技术介绍
体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、 优化基因的便捷方案，是探索启动子调节位点的有效手段，也是研究蛋白质结构和功能之 间的复杂关系的有力工具。 对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基 酸序列和蛋白质结构，进而改变蛋白质的功能。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如 研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA 作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结 构，以及药物研发、基因治疗等方面。目前定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突 变、PCR介导的定点突变、盒式突变。 寡核苷酸引物介导的定点突变，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到M13噬菌 体载体中。M13噬菌体的正链可以去感染具有性纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以 出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而留存在噬菌体内的则是双链状态的复制性 M13,受M13感染的细菌生长减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。将目的DNA插入 到复制型M13的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA作为突变的模板。根据需要合成 带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使之与带有目的DNA的单链M13模板杂交，然后加 入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物得以延伸，并用DNA连接酶使新 合成的DNA成环，再去转染细菌。可用DNA序列分析方法从得到的噬菌体中筛选出带有突 变DNA相应的片段，从而得到完整的DNA突变体。 PCR介导的定点突变是利用四种引物，进行三轮的PCR反应，其中头两轮分别扩增 出彼此重叠的DNA片段，第三轮PCR使这两条片段融合起来。它在前两轮的PCR中，应用两 个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的 双链DNA片段，两者在其重叠区段具有相同的突变。由于具有重叠的序列，所以在去除了未 参入的多余引物后，这两条双链DNA片段经变性和退火处理，便可能形成两种不同形式的 异源双链分子。其中一种具5'凹陷末端的双链分子，不能作为TaqDNA聚合酶的底物；另一 种具有3'凹陷末端的双链分子，可通过TaqDNA聚合酶的延伸作用，产生出具两重叠序列的 双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三轮PCR扩增，偏可产生 出一种突变位点远离片段末端的突变体DNA。 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基 因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要 求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。 如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多 的突变体，大大减少了突变需要的次数。 三种方法各有优点，寡核苷酸介导的方法保真度高；PCR介导的方法操作简单，突 变成功率高；盒式方法简单易行，突变效率高。但它们也各自存在着很大的缺点，寡核苷酸 介导的方法操作复杂，周期长；PCR介导的方法后续工作复杂，TaqDNA聚合酶保真性低；盒 式方法需合成多条引物成本高，受到酶切位点的限制。 综上所述，亟需一种操作简单、保真性好，且能实现一步多点突变的方法，但是目 前关于这种方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于甲基化环状DNA分子的突 变方法。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是： 一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法，包括以下步骤： a) PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA :以甲基化环状DNA为模板，使用带突变 位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增； b) 将步骤a)的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I消化，去除甲基化模板； c) 将步骤b)中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修 复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。 步骤a)中，所述的高保真的耐热DNA聚合酶为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。 所述的高保真的耐热DNA聚合酶与高温DNA连接酶的添加比例为：酶活力单位 比 1 :60。 所述的高温DNA连接酶为Taq DNA Ligase连接酶或9° N DNA连接酶。 所述的突变引物是以甲基化环状DNA为模板设计的单条引物，在突变位点前后各 保留16~20个与模板配对的碱基。 步骤b)中，使用限制性内切酶Dpn I消化的时间为5分钟至过夜。 步骤c)中，所述的消化产物是直接转入感受态细胞中。 PCR反应的体系中还包含反应缓冲液、GC反应缓冲液、dNTP、ATP、NAD+。 需要说明的是，本专利技术中，PCR反应的模板一定要甲基化，若非甲基化的DNA模板， 可先转化dam +的大肠杆菌菌株再抽提获得；尽量采用高纯度、浓度大约为50?100 ng/ μ 1的质粒；若模板大于15 kb，需将所需突变序列亚克隆到较小的载体中实施。所述的 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase其保真性能和扩增效率俱佳。 本专利技术优点在于：本专利技术的方法不但具有普通定点突变的功能，而且当遇到多个 位点突变的需求时，也可以实现一步多点突变，解决了普通单点突变只能对目标位点逐一 引入突变，耗时费力的问题，且操作简单，突变率高，单点突变阳性率95%以上，相距Ikb以 上两点、三点突变阳性率在60%以上。 【附图说明】 附图1是本专利技术的原理与操作简示图。 附图2是实施例1中氨基酸突变后的3个单菌落测序比对结果图。 附图3是实施例1中氨基酸突变3菌落测序原始峰图。 附图4是引物设计举例。 附图5是引物设计前原始模板序列及设计后突变引物序列比对图。 【具体实施方式】 下面结合附图对本专利技术提供的【具体实施方式】作详细说明。 本专利技术技术方案的总体思路为：制备甲基化模板，针对每一个目标突变只合成一 条突变引物，再利用保真性能和扩增效率俱佳的耐热DNA聚合酶，快速合成与模板互补的 带有特定突变的环状单链DNA (30 sec/1 kb)，最大限度地保持扩增质粒的保真性，大大缩 短反应时间。经过多个PCR循环反应后，带有特定突变的环状单链DNA数目成倍增长。PCR 反应结束后，采用限制性内切酶Dpn I消化甲基化的模板，而带有突变的环状单链DNA则通 过转化大肠杆菌体，在其体内修复为环状双链DNA，最终得到带有突变组的DNA质粒。 一、试剂准备 1、突变混合酶的配制：2 U/μΙ Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB M0530)与 4〇υ/μ I Taq DNA Ligase 连接酶 （NEB M0208)或者 40U/μ I 9。N DNA 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法，其特征在于，包括以下步骤：a）PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA：以甲基化环状DNA为模板，使用带突变位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增；b）将步骤a）的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I消化，去除甲基化模板；c）将步骤b）中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。

【技术特征摘要】
1. 一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法，其特征在于，包括以下步骤： a) PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA :以甲基化环状DNA为模板，使用带突变 位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增； b) 将步骤a)的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I消化，去除甲基化模板； c) 将步骤b)中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修 复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。2. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤a)中，所述的高保真的耐热DNA 聚合酶为 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。3. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤a)中，所述的高温DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋国成，陈旭，陈刚，佟勇，
申请(专利权)人：依科赛生物科技太仓有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32