一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的重组HbpA2蛋白及其制备方法。本发明专利技术重组HbpA2蛋白良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，说明重组蛋白HbpA2是副猪嗜血杆菌的保护性抗原，可以制备成为疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2及其制备方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2及其制备方法。
技术介绍
副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)属于巴斯德菌(Pasteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)，为革兰阴性细小杆菌，具有多种形态，定植于健康猪上呼吸道，属于正常菌群，在免疫抑制等特定条件下会引起猪格氏病(Glasser’sdis-ease，以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎为主要特征。近些年来由于猪场规模化养殖的快速发展，尤其是工厂集约化养殖，猪格氏病已经呈世界性流行和暴发，表现出突然死亡率、发病率和病死率较高，严重危害养猪业发展，并造成巨大经济损失。我国近年来才开始逐渐重视对副猪嗜血杆菌病的研究。副猪嗜血杆菌的血清型众多，目前已鉴别十五种血清型，还有15％-41％的未鉴定血清型，其中1，5，10，12，13和14为强毒株，而我国流行的血清型为4型和5。不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大，我们对其毒力因子及致病机理知之甚少，至今尚无有效的通用商品苗和敏感的诊断方法，该病尚未得到有效控制，给全球养猪业带来巨大的经济损失。我国至今没有像猪瘟兔化弱毒疫苗、伪狂犬基因缺失疫苗那样的成熟疫苗来针对副猪嗜血杆菌病，目前大多都是传统型灭活苗和弱毒苗，缺乏良好的保护力，导致临床病例多见。而灭活疫苗只能对同种血清型的菌株具有保护作用，缺乏交叉保护力。副猪嗜血杆菌血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了对具有高效交叉保护力疫苗的研制。亚单位疫苗同时具有活疫苗免疫效力高、交叉保护力强以及灭活苗的安全性好等优点，具有十分广阔的应用前景。大部分不能分型菌株副猪嗜血杆菌及其血清型的多样性影响了人们对于具有高效交叉保护力疫苗的研制。血红素结合蛋白(heme-bindingprotein，HbpA)是一种球蛋白，广泛存在于致病菌中。有研究发现HbpA蛋白分子中有一个或多个与血红素结合区域，具有结合、运输和传递血红素，参与机体代谢等生理功能，HbpA蛋白是一种重要的毒力因子，与细菌的致病性密不可分。在巴斯德菌科嗜血杆菌属的流感嗜血杆菌上的研究表明，HbpA蛋白是流感嗜血杆菌的一种重要的毒力因子，HbpA蛋白与血红素的利用有关。目前关于副猪嗜血杆菌HbpA蛋白的功能的研究报道较少，在已进行基因组测序的副猪嗜血杆菌SH0165中发现有两个HbpA基因，两个基因的大小均为1595bp。公开号为CN103288934A的专利申请公开了一种采用基因工程的方式重组表达HbpA基因(GeneID:7276898)的方法，但是，其制备的重组HbpA蛋白能小鼠感染副猪嗜血杆菌的保护力不佳，其免疫保护效果仅50％。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新的重组HbpA蛋白及其制备方法。本专利技术提供了一种如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。本专利技术重组载体，其特征在于：包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。其中，所述的重组载体是重组pET-39b质粒。本专利技术重组菌，它包含前述的重组载体。其中，所述的重组菌为重组大肠杆菌。本专利技术重组HbpA2蛋白，它由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术制备重组HbpA2蛋白的方法，包含如下步骤：ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50μg/ml的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、280r/min摇床培养，至OD600值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2～1.5mmol/L，25～42℃诱导表达1～7h；12h；ⅱ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。步骤ⅰ中，IPTG的终浓度为1.5mmol/L，诱导表达的温度为30℃；诱导表达的时间为5h。步骤ⅱ中，所述分离纯化的方法如下：(1)将上清液用1mmol/LNaOH调pH至8.0，使用0.45μm的滤膜过滤样品；(2)用上样缓冲液平衡镍离子螯合亲和层析填料层析柱，上样，按顺序用含有30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗头，收集用含有100mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱得到的溶液，即可；其中，上样缓冲液包含如下浓度的成分：50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,5mmol/L咪唑；洗脱缓冲液包含如下浓度的成分：50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl。本专利技术采用基因工程的方式成功的构建了基因工程菌，并表达得到了重组蛋白HbpA2。该重组蛋白HbpA2具有良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，保护率高达70％，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，可以制备成为亚单位疫苗，预防副猪嗜血杆菌病，临床应用前景良好。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1HbpA2基因的PCR扩增结果图。M:DNAmaker；1、2、3：PCR扩增产物；图2诱导时间优化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：诱导时间为：0、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h；图3IPTG诱导浓度优化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：IPTG:终浓度为：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L；图4诱导温度优化。M：蛋白maker；1、3、5、7：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导前；2：诱导温度为25℃；4：诱导温度为30℃；6：诱导温度为37℃；7：诱导温度为42℃；图5HbpA2蛋白在pET-39b-HbpA2(BL21)中表达的形式检测。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2：pET-39b-HbpA2(BL21)超声波破碎后；3：上清；4：沉淀；图6重组HbpA2表达的SDS-PAGE。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)诱导前；2：pET-39b(BL21)诱导后；3：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导前；4：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导后；5：HbpA2蛋白纯化后(100mmol/L咪唑洗脱)；图7重组蛋白Westernblotting；图8小鼠存活率与时间的关系。具体实施方式实验材料和试剂：副猪嗜血杆菌CVCC3361，来源于国家兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号：CVCC3361。大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。限制性内切酶、Ex-TaqDNA聚合酶、DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNAMarker、pMD19-Tsimple载体等均购自宝生物(大连)工程有限公司。细菌基因组提取试剂盒为Omega公司产品。预染蛋白Ladder为NEB公司产品。小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。LB培养基的配方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；其中，所述的重组载体是重组pET-39b质粒。3.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2所述的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。5.一种重组HbpA2蛋白，其特征在于：它由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列编码。6.根据权利要求5所述的重组HbpA2蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。7.一种制备权利要求6所述重组HbpA2蛋白的方法，其特征在于：包含如下步骤：ⅰ、取权利要求4所述的重组大肠杆菌，接种到添加有终浓度为50μg/ml的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、280r/min摇床培养，至OD600值达到0.5~0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2~1.5mmol/L，25~42℃诱导表达1...

【专利技术属性】
技术研发人员：文心田，曹三杰，周鹏，文翼平，黄小波，伍锐，张禄滑，代科，何绿琴，丁玲强，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51