本发明专利技术涉及检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒。所述的引物由一对外引物和一对内引物组成，核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1-4。试剂盒内有引物混合液、环介导等温扩增混合液、恒温扩增反应液Ⅰ，梨火疫病菌阳性对照DNA。检测梨火疫病菌的方法包括待检样品总核酸提取、LAMP恒温扩增、扩增核酸SYBR Green I荧光染色法判断反应结果。本发明专利技术的试剂盒根据梨火疫病菌菌株致病质粒pEA29上一段保守基因序列设计引物，保证了检测方法的特异性。
【技术实现步骤摘要】
一种检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒
本专利技术属生物检测
，具体涉及一种检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引 物及试剂盒。
技术介绍
梨火疫病菌（Eriwinia amylovora(Burrill)Winslow et al)是国际上的重要植 物检疫对象，在我国新出台的《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》被列 为检疫性有害生物，由该病菌引起的梨火疫病是经济作物苹果、梨、山楂等的毁灭性病害。 梨火疫病最早在北美洲被发现，近几十年。随着世界贸易的发展该病随种苗、果实及包装材 料迅速传播，几乎遍及整个欧洲大陆。各国对梨火疫病都十分敏感，多数国家都将其列为检 疫性有害生物。近年来，为了满足国内市场的需求，我国相继从韩国、日本等地大量引进优 良梨、苹果苗木及果实。因此，梨火疫病已经对我国果品生产和进出境水果贸易构成潜在威 胁。梨火疫病菌可侵染蔷薇科40余属的220多种植物，给当地生物的多样性和农业带来 巨大危害，也给水果贸易造成了壁垒。中国广泛存在梨火疫病的适生条件和感病寄主，其广 阔的温带气候地区也是该病害的适生区，这里集中了中国主要的苹果产区，随着高感病苹 果栽培品种如嘎啦、乔纳金的种植推广，该病害的入侵风险进一步增加。梨火疫病菌一般从 寄主的花器侵入，然后引起枯枝和整个植株死亡，最典型的症状是花、果实和叶片受火疫 病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。梨火疫病远 距离传播主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟 及气流。其中最危险的传播途径是通过病接穗、苗木、果实的传带。目前国内还没有梨火疫 病的发生，但梨火疫病的人为和自然传播对中国构成了潜在威胁，尤其是相邻的日本已经 有梨火疫病的分布，准确灵敏的检测技术是阻止该病害传入的有效手段。 目前，国内对梨火疫病的检疫尚无检测标准。其检验方法亦很多，从经典的分离培 养、致病性测定、症状观察等到先进的分子生物学技术包括DNA探针、PCR技术的应用及脂 肪酸分析、单克隆抗体的应用等，但在检疫上采用较多的为免疫荧光荧光染色结合致病性 测定确诊的方法，检测周期太长，不能适应进出口商品的实际需求。近年来，许多新的分子 生物学研究方法也应用在梨火疫病菌的检疫上。这些方法虽然特异性高，检测周期短，但均 需要PCR后处理，通常需要一至几天才能完成，另一个问题是PCR后处理常常出现污染而影 响试验的准确性和可靠性
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物，第二目的是提 供了一种利用该引物检测梨火疫病菌的试剂盒，从而能够实现对梨火疫病菌进行准确快速 的检测，弥补现有技术的不足。 本专利技术一个方面涉及检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物，为一对外侧引物 F3、B3和一对内侧引物FIP、BIP，其核苷酸序列分别为SEQ ID N0:l-4。 本专利技术另一个方面提供一种梨火疫病菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，包括 有如下的组分 ： 1)引物混合液：80 4 111〇1/1引物卩1?2 4 1^8(^111〇1/1引物81?2 4 1^1(^111〇1/1 引物 F32 μ L，10 μ mol/L 引物 B32 μ L ; 2)环介导等温扩增混合液：8U/ μ L Bst DNA PoLymerase 2 μ L，2· 5 μ mol/ LdNTP 4yL，IXThermoL Buffer 2.5uL，ddH20 31. 5 μ L ;其中 IXThermol Buffer 成分 为：20mmol/LTris-HCl，lOmmol/LKCl, 10mmol/L(NH4)2S04, 2mmol/LMgS04, 0· 01 % Triton X-100 ； 3)梨火疫病菌阳性对照DNA 2 μ L。 4)荧光显色剂：成分为IOOX的荧光染料SYBR GREEN I。 本专利技术的梨火疫病菌的环介导恒温扩增（LAMP)检测试剂盒的操作方法如下： 1)待测样品中DNA模板的提取：用市售的DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取 待测样品中DNA。其中提取的样品DNA的纯度比值0D260/0D280在1. 6-2. 0范围内，核酸浓 度在40-100ng/ μ L范围内。 2) LAMP恒温扩增：在PCR管中加入引物混合液8 μ L、环介导等温扩增混合液 40 μ L、模板DNA 2 μ L，混合。将配制好的PCR管于61 °C水浴锅中恒温反应60min，然后 80°C IOmin终止反应，降温至4°C。 3) SYBR Green I荧光染色法判断反应结果：在反应产物中加入3μ 1荧光显色剂 轻轻混匀，静置5min进行显色观察。若显现绿色则待测样品中含有梨火疫病菌；显现橙色 则待测样品中不含有梨火疫病菌。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应重新检测。 本专利技术的试剂盒用于检测植物产品中的梨火疫病菌。 与现有技术相比，本专利技术的引物特异性强，灵敏度好；无需PCR的后处理，大大降 低了污染的可能性，检测时间短，效率高；检测仪器简单，只需要普通的水浴锅，降低了设备 投入，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。 【附图说明】 图I :LAMP引物特异性扩增实验结果，图1中A为凝胶电泳结果图，B为SYBR Green I检测图； 其中：M :DL 2000DNA Marker ; 1 :梨火疫病菌（Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.)标准菌株（ATCC菌株编号：51853) ;2 :梨火疫病菌标准菌株（ATCC菌株 编号：51853) ;3 :亚洲梨火疫病菌（Erwinia pyrifoliae)菌株（CGMCC菌株编号：1. 7277); 4 :杓兰欧文氏菌（Erwinia cypripedii)标准菌株（ATCC菌株编号：29268) ;5 :菊基腐病 菌（Erwinia chrysanthemi)菌株（ACCC菌株编号：04160) ;6 :嗜维管束欧文氏菌（Erwinia tracheiphila)标准菌株（ATCC菌株编号：27004) ;7 :番石槽欧文氏菌（Erwinia psidii) 标准菌株（ATCC菌株编号：49406) ;8 :大黄欧文氏菌（Erwinia rhapontici) (CGMCC菌株编 号：1. 6978)9 :阴性对照；10 :空白对照。以无菌水作为空白对照，以灭菌的去离子水代替模 板的反应溶液作为阴性对照。该实验的目的是为了验证该专利技术中LAMP引物的特异性。 图2 :待检梨叶片样品的梨火疫病菌LAMP扩增实验结果； 其中：1 :阴性对照；2-3:梨火疫病菌标准菌株（ATCC 51853) ;4 :空白对照；5:DL 2000DNA Marker (从上至下分别为 2000、1000、750、500、250 和 IOObp) ;6-8:受梨火疫病菌 侵染的梨叶片A，B，C ;9:未受梨火疫病菌侵染的梨叶片D。以无菌水作为空白对照，以灭菌 的去离子水代替模板的反应溶液作为阴性对照。该本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物，其特征在于,所述的引物为F3、B3、FIP和BIP，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1‑4。
【技术特征摘要】
1. 一种检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物，其特征在于，所述的引物为F3、B3、 FIP和BIP，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO :1-4。2. 权利要求1所述的引物在制备检测检测梨火疫病菌制品中的应用。3. -种梨火疫病菌的环介导恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如 下的组分： 1) 引物混合液：8011111〇1/1引物卩1?2111，8011111〇1/1引物81?2111，1011111〇1/1引物 F32 ii L，10 ii mol/L 引物 B32 ii L ; 2) 环介导等温扩增混合液：8U/iiL Bst DNA PoLymerase 2iiL，2.5iimol/LdNTP 4iiL，lXThermoL Buffer 2.5uL，ddH20 31.5 iiL;其中 lXThermol Buffer 成分为： 20mmol/LTris-HCl, 10mmol/LKCl，10mmol/L(NH4)2S04, 2mmol/LMgS04, 0? 01 % Triton X-100...
【专利技术属性】
技术研发人员：封立平，倪新，余冬冬，吴兴海，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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