作为生物分子的标记染料的吲哚衍生物制造技术

用作具有与已知荧光化合物相当的特性的标记的吲哚衍生物。该化合物可以与用于生物成像和分析的蛋白质和核酸缀合。提供了所述化合物的合成、缀合化合物的形成和用途以及它们各自的非限制性实例。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为生物分子的标记染料的吲哚衍生物 本申请要求2012年3月2日提交的序列号为61/606, 210和2012年10月26日 提交的序列号为61/718, 805的待审美国申请的优先权，通过参考将它们各自明确、完整地 引入本文。 公开了可用作具有与已知荧光化合物相当的特性的标记物的化合物。该化合物可 以与蛋白质和核酸分子缀合以便进行生物成像和分析。公开了所述化合物的合成、缀合化 合物的形成和用途和以及它们各自具体的非限制性实例。 与生物分子（例如抗原、抗体、具有相应互补种类的DNA-片段，所述互补种类用于 体外和体内测定酶动力学、受体-配体相互作用、核酸杂交动力学等）反应的化合物（被称 作标记物或染料）可用于例如受体和药物的药理学表征、结合数据等。化合物例如咕吨?翁 盐（美国专利No. 5, 846, 737)和/或菁蓝类（美国专利No. 5, 627, 027)用于这类应用，但 由于其η-系统的平面性，它们聚集并且形成二聚体，尤其是在水溶液中。亲水性不足的化 合物与不同表面发生非特异性相互作用，导致在尝试纯化相应的缀合物时产生问题，以及 不令人满意的信噪比。 针对通过引入增加化合物亲水性的取代基来减少不期望的特性进行了尝试。例 如，已经将磺酸官能取代基引入菁蓝发色团。美国专利No. 6, 083, 485 (Licha)以及美国专 利 Nos. 6, 977, 305 和 6, 974, 873 (Molecular Probes)公开了菁蓝化合物，其在被 ω-羧基 烷基官能取代的末端吲哚杂环的3-位上具有常用的甲基之一，且其中先前存在的（例如在 Cy3或Cy5上）N-烷基或N-ω -羧基烷基官能被N-ω -烷基磺酸官能替代。W005/044923 公开了在被ω -羧基烷基官能取代的末端吲哚杂环的3-位上具有常用的甲基取代基的菁 蓝化合物。在这些公开文献中，具有多于2个的磺酸官能取代基的菁蓝化合物显示比美国 专利No. 5, 627, 027中所述菁蓝化合物（Cy3, Cy5)更高的溶解度和相应更低的二聚体形成 倾向。 所公开的菁蓝化合物可用作光学，尤其是荧光光学、测定和检测方法中的标记物。 所述化合物具有高亲水性、高摩尔吸光度、高对光稳定性和高贮存稳定性。这些化合物可以 被紫外线（UV)、可见光和近红外（NIR)光谱区中的单色（例如激光、激光二极管）或多色 (例如白光源）光激发。 典型的应用方法基于所述化合物与生物分子例如蛋白质（例如抗原、抗体等）、具 有相应互补种类的DNA和/或RNA片段等的反应。因此，除了其它实施方案以外，所述化合 物还可用于体外和/或体内测定酶动力学、受体-配体相互作用和核酸杂交动力学。所述 化合物可用于受体和/或药物的药理学表征。应用包括，但不限于在药物、药剂、生物科学、 材料科学、环境控制、天然存在的有机和无机微量样品的检测等。 将如下命名法用于描述实施方案：550化合物1/X、550化合物2/X、550化合物3/ X、550化合物4/X、550化合物5/X、550化合物6/X、650化合物1/X、650化合物2/X、650化 合物3/X、650化合物4/X、650化合物5/X、650化合物6/X、755化合物1/X、755化合物2/X、 755化合物3/X、755化合物4/X、755化合物5/X、755化合物6/X，其中550、650和755化合 物分别包含3个碳、5个碳和7个碳原子的多次甲基链；第一个数字是吲哚N上乙二醇、二甘 醇或（聚）乙二醇（本文将其共同称作PEG)的长度，例如1是吲哚N上的乙二醇（PEG1)， 2是上吲哚N的二甘醇（PEG2), 3是吲哚N上的（聚）乙二醇（聚=3, PEG3), 4是吲哚N上 的（聚）乙二醇（聚=4, PEG4), 5是吲哚N上的（聚）乙二醇（聚=5, PEG5), 6是吲哚N 上的（聚）乙二醇（聚=6, PEG6);并且X是所述化合物上PEG基团的总数。例如，650化 合物4/4包含吲哚N上的PEG 4和该化合物上总计4个PEG基团。 在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在一个杂环的N-位上具有乙二醇、二甘醇或 乙二醇聚合物（即聚乙二醇，缩写为PEG)，而另一个杂环在N-位上具有用于使所述化合物 与生物分子缀合的官能团，以及该菁蓝化合物的另一个位置上的乙二醇、二甘醇或乙二醇 聚合物（即聚乙二醇，缩写为PEG)。在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在该化合物的任意 位置上具有至少一个磺基和/或磺烷基。在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在该化合物 的任意位置上具有磺酰胺和/或羧酰胺，其包含直接或间接连接至所述化合物的乙二醇基 或乙二醇聚合物（即聚乙二醇，缩写为PEG)。间接连接表示使用连接基，直接连接表示没有 这种连接基。连接基可以是任意部分。 在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在一个杂环的N-位上具有乙二醇、二甘醇或 乙二醇聚合物（即聚乙二醇，缩写为PEG)，而另一个杂环在N-位上具有乙二醇、二甘醇或 乙二醇聚合物（即聚乙二醇，缩写为PEG)和用于使所述化合物与生物分子缀合的官能团， 以及苯并菁蓝化合物的另一个位置上的乙二醇基或乙二醇聚合物（即聚乙二醇，缩写为 PEG)。在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在该化合物的任意位置上具有至少一个磺基和 /或磺烷基。在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在该化合物的任意位置上具有磺酰胺和 /或羧酰胺，其包含直接或间接连接至所述化合物的乙二醇、二甘醇或乙二醇聚合物（即聚 乙二醇，缩写为PEG)。间接连接表示使用连接基，直接连接表示没有这种连接基。连接基可 以是任意部分。 附图简述 图IA-C显示化合物和缀合的化合物的最大吸收。 图2显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的荧光板功能测定结 果。 图3显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的荧光板功能测定结 果。 图4显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的荧光板功能测定结 果。 图5显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的荧光板功能测定结 果。 图6显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的荧光板功能测定结 果。 图7显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的荧光板功能测定结 果。 图8显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的荧光板功能测定结 果。 图9显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的荧光板功能测定结 果。 图10A-B显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的总体未结合的 荧光强度的平均值。 图IlA-B显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的总体未结合的 荧光强度的平均值。 图12A-B显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的总体未结合的 荧光强度的平均值。 图13A-B显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的总体未结合的 荧光强度的平均值。 图14A-E显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的免疫荧光测定 结果。 图15显不表不为突光强度的图14的免疫突光测定结果。 图16显示表示为信号-背景比率的图14的免疫荧光测定结果。 图17A-D显示在一个实施方案中使用本专利技术化合物和商业染料的免疫荧光测定 结果。 图18显示表示为荧光强度的本文档来自技高网...

【技术保护点】
通式IIa的化合物，或通式IIb的化合物，其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P‑L‑Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基‑L‑SO2NH‑P‑L‑Z和羧酰胺基‑L‑CONH‑P‑L‑Z；R7和R8各自相同或不同且独立地选自H；SO3；PEG基团P‑L‑Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基‑SO2NH‑P‑L‑Z和羧酰胺基‑CONH‑P‑L‑Z；其中L选自二价线性(‑(CH2)o‑，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其任选地被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、‑COO‑、‑COOH、‑COSH、CO‑NH‑NH2、‑COF、‑COCl、‑COBr、‑COI、‑COO‑Su(琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、‑COO‑STP(4‑磺基‑2,3,5,6‑四氟苯基)、‑COO‑TFP(2,3,5,6‑四氟苯基)、‑COO‑苯并三唑、‑CO‑苯并三唑、‑CONR'‑CO‑CH2‑I、‑CONR'R″、‑CONR'‑生物分子、‑CONR'‑L‑COO‑、‑CONR'‑L‑COOH、‑CONR'‑L‑COO‑Su、‑CONR'‑L‑COO‑STP、‑CONR'‑L‑COO‑TFP、‑CONR'‑L‑CONR″2、‑CONR'‑L‑CO‑生物分子、‑CONR'‑L‑CO‑NH‑NH2、‑CONR'‑L‑OH、‑CONR'‑L‑O‑亚磷酰胺、‑CONR'‑L‑CHO、‑CONR'‑L‑马来酰亚胺和‑CONR'‑L‑NH‑CO‑CH2‑I；R'和R″选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自‑OH、‑SH、‑NH2、‑NH‑NH2、‑F、‑Cl、‑Br、I、‑NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、‑O‑TFP(2,3,5,6‑四氟苯氧基)、‑O‑STP(4‑磺基‑2,3,5,6‑四氟苯氧基)、‑O‑苯并三唑、‑苯并三唑、‑NR‑L‑OH、‑NR‑L‑O‑亚磷酰胺、‑NR‑L‑SH、‑NR‑L‑NH2、‑NR‑L‑NH‑NH2、‑NR‑L‑CO2H、‑NR‑L‑CO‑NHS、‑NR‑L‑CO‑STP、‑NR‑L‑CO‑TFP、‑NR‑L‑CO‑苯并三唑、‑NR‑L‑CHO、‑NR‑L‑马来酰亚胺和‑NR‑L‑NH‑CO‑CH2‑I，其中R是‑H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；o是0～12的整数，包含端值本身；且n是1～3的整数，包含端值本身；条件是R1、R2、R5、R6、R7和R8中的至少一个包含PEG基团。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.02 US 61/606,210;2012.10.26 US 61/718,8051.通式IIa的化合物，或通式IIb的化合物，其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带 有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和（聚）乙二醇 基，其中所述（聚）乙二醇基是（CH 2CH2O) s，其中s是3?6的整数，包含端值本身；磺酰胺 基-L-SO2NH-P-L-Z 和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z ; R7和R8各自相同或不同且独立地选自H ;S03 ;PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二 甘醇基和（聚）乙二醇基，其中所述（聚）乙二醇基是（CH2CH2O) s，其中s是3?6的整数， 包含端值本身；磺酰胺基-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-CONH-P-L-Z ; 其中L选自二价线性（-(CH2)。_，〇 = 0?15)、交叉或环状烷基，其任选地被至少一个 选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代； 其中 Z 选自 H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO' -C00H、-COSH、C〇-NH-NH2、-C0F、-C0C1、-C OBr、-COI、-COO-Su (琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基）、-COO-STP (4-磺基-2, 3, 5, 6-四 氟苯基）、-COO-TFP (2, 3, 5, 6-四氟苯基）、-C00-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-C0NR' -CO-C H2-I、-C0NR' R、-C0NR' -生物分子、-C0NR' -L-COO'-C0NR' -L-C00H、-C0NR' -L-COO-Su、-C ONR' -L-COO-STP、-C0NR' -L-COO-TFP、-C0NR' -L-CONR 2、-C0NR' -L-CO-生物分子、-C0NR' -L-C〇-NH-NH2、-C0NR' -L-0H、-C0NR' -L-O-亚磷酰胺、-C0NR' -L-CH0、-C0NR' -L-马来酰亚胺 和-C0NR'-L-NH-CO-CH2-I ;R'和R选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋 白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原； X 选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS (羟基琥珀酰亚胺基 / 磺基 琥珀酰亚胺基）、-O-TFP(2, 3, 5, 6-四氟苯氧基）、-O-STP(4-磺基-2, 3, 5, 6-四氟苯氧 基）、-0-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH 2、-N R-L-NH-NH2、-NR-L-C02H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三 唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH 2-I,其中R是-H或脂族基团或杂脂 族基团； Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0?5的 整数，包含端值本身；〇是〇?12的整数，包含端值本身；且η是1?3的整数，包含端值本 身；条件是R1、R 2、R5、R6、R7和R8中的至少一个包含PEG基团。2.化合物，其选自下组化合物其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带 有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和（聚）乙二醇 基，其中所述（聚）乙二醇基是（CH 2CH2O) s，其中s是3?6的整数，包含端值本身；磺酰胺 基-L-SO2NH-P-L-Z 和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z ; R7和R8各自相同或不同且独立地选自H ;S03 ;PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二 甘醇基和（聚）乙二醇基，其中所述（聚）乙二醇基是（CH2CH2O) s，其中s是3?6的整数， 包含端值本身；磺酰胺基-SO2NH-P-L-Z或羧酰胺基-CONH-P-L-Z ; 其中L选自二价线性（-(CH2)。_，〇 = 0?15)、交叉或环状烷基，其任选地被至少一个 选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代； 其中 Z 选自 H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO' -C00H、-COSH、C〇-NH-NH2、-C0F、-C0C1、-C OBr、-COI、-COO-Su (琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基）、-COO-STP (4-磺基-2, 3, 5, 6-四 氟苯基）、-COO-TFP (2, 3, 5, 6-四氟苯基）、-C00-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-C0NR' -CO-C H2-I、-C0NR' R、-C0NR' -生物分子、-C0NR' -L-COO'-C0NR' -L-C00H、-C0NR' -L-COO-Su、-C ONR' -L-COO-STP、-C0NR' -L-COO-TFP、-C0NR' -L-CONR 2、-C0NR' -L-CO-生物分子、-C0NR' -L-C〇-NH-NH2、-C0NR' -L-0H、-C0NR' -L-O-亚磷酰胺、-C0NR' -L-CH0、-C0NR' -L-马来酰亚胺 和-C0NR'-L-NH-CO-CH2-I ;R'和R选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋 白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原； X 选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS (羟基琥珀酰亚胺基 / 磺基 琥珀酰亚胺基）、-O-TFP(2, 3, 5, 6-四氟苯氧基）、-O-STP(4-磺基-2, 3, 5, 6-四氟苯氧 基）、-0-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH 2、-N R-L-NH-NH2、-NR-L-C02H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三 唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-C0-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂 族基团； Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0?5的 整数，包含端值本身；〇是〇?12的整数，包含端值本身； R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团、杂脂族基团或PEG基团P-L-Z，其 中P选自乙二醇基、二甘醇基和（聚）乙二醇基，其中所述（聚）乙二醇基是（CH2CH2O) 3，其 中s是3?6的整数，包含端值本身；或R3和R4 -起形成环状结构，其中R3和R4使用选 自-(CH上-、-(CH上0 (CH上，-、-(CH上S (CH上，-、-(CH上CH = CH-、-OCH = CH-的二价结构 元件结合，其中q和q'各自相同或不同并且是2?6的整数，包含端值本身；且 Y选自氢；烧基；磺烷基；氟；氯；溴；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·赫曼森，P·T·斯泽尼，S·德赛，M·S·文泽尔，B·R·迪沃奇，F·G·莱曼，M·C·恩兰德，
申请(专利权)人：皮尔斯生物科技有限公司，迪奥米克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US