利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法。本发明专利技术通过TrxA-PI融合表达载体的构建、对大肠杆菌表达菌株的选择、诱导条件的优化以及重组蛋白的提取纯化等各方面的改进能够有效提高可溶性胰岛素原的表达，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可溶性胰岛素原制备
，特别是涉及一种利用大肠杆菌表达系 统获得可溶性胰岛素原的方法。
技术介绍
糖尿病（Diabetes mellitus，DM)是多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢 紊乱，是由于体内胰岛素绝对或相对缺乏或靶组织对胰岛素不敏感而引起的综合病症，是 环境和遗传两个因素长期共同作用的结果。根据世卫组织（WHO)预测，2020年以后全世界 糖尿病患者人数可能突破4个亿。糖尿病因其病因复杂，并发症多，治愈率低，成为国际国 内一大医学难题，也带来了严重的经济和社会问题，被WHO称为不死的癌症。糖尿病的治疗 药物有很多种，胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，是最直接最有效的治 疗糖尿病药物之一，胰岛素制剂现在已占到了整个糖尿病用药30%以上的市场份额。 人胰岛素（human-insulin, HIN)是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄 糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激动而分泌的一种蛋白质激素。在人的β细胞细 胞核中，第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA在内质网上翻译成前 胰岛素原（Preproinsulin);前胰岛素原通过内质网膜时，被信号肽酶切去N端信号肽，生 成胰岛素原（Proinsulin，PI)，同时PI分子内形成3个二硫键；PI随胞浆中的微泡进入高 尔基体，经蛋白水解酶的作用，断裂生成没有作用的C肽，同时生成胰岛素（Insulin)分泌 到β细胞外，进入血液循环作为一种激素行使降血糖的功能。 人的Preproinsulin由110个氨基酸残基组成。由N端至C端连接顺序为 S-B-Arg-Arg-C-Lys-Lys-A,其中 S :signal peptide 信号肽，24 个氨基酸残基；C :C 肽，31 个氨基酸残基，不同种属动物的C肽不同；A和B分别为胰岛素的A链（21个氨基酸)和B链 (30个氨基酸)。整个PI分子含有3对二硫键，其中2对链间二硫键（A6 - B6，A20 - B19)位于B链和A链之间，1对链内二硫键（A6 - All)位于A链内部。 早期用于临床的Insulin几乎都是从猪、牛胰脏中提取的。由于Insulin需求 量巨大，促使人们不断改进工艺和采用新的技术成果生产Insulin。DNA重组技术的出现 为Insulin的生产开创了新的途径。近几十年来，基于对Insulin分子结构及功能更加 深入的了解，人们不仅实现了人胰岛素在大肠杆菌co/i)中的生物合成并 推向市场，而且PI及其类似物基因在许多系统如毕赤酵母（Biotechnol Appl Biochem, 1999，29:78-86; Biotechnol Bioeng, 2001,73:74-79)、酿酒酵母（Appl Microbiol Biotechnol, 2000，54: 277-286; J Biol Chem, 2002，277: 18245-18248)、哺乳动物 细胞（Sci R印，2014，4: 6465)、转基因植物（Nat Biotechnol 1998,16:934-938; Plant Biotech J， 2006， 4: 77-85; Plant Biotech J， 2011， 9: 585-598; Genet Mol Res， 2010，9 :1163-1170; Jundishapur J Nat Pharm Prod，2014，9: 9-15)中都得到了表 达。现在上市的基因工程Insulin主要有2种生产工艺，分别为美国礼来公司（Eli Lilly and Company)的E 表达系统和丹麦诺和诺德公司（Novo Nordish)的酵母表达系统。 1998年12月，我国通化东宝药业利用万.co/i表达系统生产的重组HIN填补了我国能够生 产及销售重组Insulin药物的空白，成为中国最大的重组HIN生产厂家。 虽然选择枯草杆菌（Biochem Biophys Res Commun, 1990，169:297 - 301 ;Appl Microbiol Biotechnol，2003，62: 369 - 373 ;Curr Microbiol, 2013，67: 1-8)、链霉 菌（Biotechnology (NY) 1989，7:1055 - 1059)、酵母菌作为宿主生产PI都可实现分泌表 达，但PI产量并未比万.表达系统提高多少。万.作为研究最早和最透彻的模式微 生物，由于其分子遗传学背景清楚、培养条件简单、生长快、成本低、易大规模培养等优势， 自基因重组技术专利技术以来，很快被用于重组HIN的生产。1986年礼来公司构建的色氨酸合 成酶-human-PI融合蛋白表达载体转化凡co/i，表达的融合蛋白形成包涵体，包涵体纯化 后经CNBr裂解获得PI，经变性和复性能够折叠成天然构象的PI。复性后具有天然构象的 PI分别经过胰蛋白酶和羧肽酶B处理后，得到去除C肽的HIN (Inouye M. Experimental Manipulation of Gene Expression. New York: Academic Press. 1983)。礼来公司至今 仍采用此方法进行重组HIN的商业化生产。 凡cWi表达系统没有翻译后修饰、糖基化等功能，同时其高度还原性的胞质环 境缺乏催化和辅助肽链折叠的酶系和辅因子（Microb Cell Fact，2014，13:141)，利用 凡co/i表达系统得到的重组蛋白往往表达量低、形成包涵体。Insulin是含有3对二硫键 的结构复杂的小分子双链多肽，在胞质中需要二硫键正确配对；而万.cWi胞质内呈还原环 境，不能形成二硫键，导致PI在空间结构上形成错误折叠，形成没有生物学活性的包涵体。 虽然包涵体可以高纯度高浓度分离且免受胞内酶降解，但经复性再次折叠的重组PI其生 产成本增加，终产量降低，为大规模工业化生产带来不利。 自 1981 年重组HIN开始在万· co/i 中异源表达（Science, 1983，219: 632-637)， 随着基因工程的发展，已发展出多种表达策略，PI或在凡CWi胞质中形成包涵体，再复性 得到活性形式；或在周质空间中获得可溶性表达，但产量较包涵体低（Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 561 - 565; Biotechnol Lett, 1991, 13: 755-760; Biotechnol. Lett, 1993, 15: 661 - 666; J Biotechnol, 1994, 36: 45-54; J Biotechnol, 2004, 109: 31-43 ;生物技术通讯，2003, 14:387-389 ;中国生物工程杂志，2004,24 :47-50 ;武汉大学 学报（医学版)，2010, 31:281-287 ;江西农业学报，2012,24 :13-17 ;汕头大学医学院学报， 2014, 27:5-8)。 有研究者选用融合表达（融合伴体加目标蛋白）策略来促进重组PI可溶性表 达。融合伴体通常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于，（1）对人源PI基因进行了密码子优化，合成了经过密码子优化的基因；（2）设计引物，PCR扩增后，将经过密码子优化的基因融合TrxA蛋白构建融合表达载体；（3）转入大肠埃希氏菌NKYBYP表达菌株，发酵； （4）将发酵后的菌体超声破碎，分离纯化上清液中TrxA‑PI融合蛋白； （5）融合蛋白经肠激酶酶切、亲和层析纯化后获得PI纯品。

【技术特征摘要】
1. 一种利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征在于， (1) 对人源PI基因进行了密码子优化，合成了经过密码子优化的基因； (2) 设计引物，PCR扩增后，将经过密码子优化的基因融合TrxA蛋白构建融合表达载 体； (3) 转入大肠埃希氏菌NKYBYP表达菌株，发酵； (4) 将发酵后的菌体超声破碎，分离纯化上清液中TrxA-PI融合蛋白； (5) 融合蛋白经肠激酶酶切、亲和层析纯化后获得PI纯品。2. 根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征 在于，步骤（1)中将人源PI基因的密码子优化为凡⑶以偏爱密码子，经过密码子优化的基 因序列为： ATGGCACTGTGGATGCGTCTGCTGCCGCTGCTGGCCCTGCTGGCCCTGTGGGGTCCGGATCCAGCCGCAGC ATTCGTTAATCAGCATCTGTGTGGCAGCCATCTGGTGGAAGCGCTGTATCTGGTTTGCGGTGAACGTGGCTTTTTC TATACCCCGAAAACCCGTCGTGAAGCGGAAGATCTGCAGGTGGGCCAGGTGGAACTGGGTGGCGGTCCAGGCGCAG GCAGCCTGCAGCCACTGGCGCTGGAGGGCAGCCTGCAAAAGCGTGGCATTGTGGAACAGTGCTGCACCAGCATTTG TAGCCTGTATCAGCTGGAAAACTATTGTAATo3. 根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特 征在于，步骤（2)中设计引物，含NcoI和Xho I酶切位点的引物如下： 5' -3' ATCCATGGCATTCGTTAATCAGCATCTGTGTG 3' -5， CGCGCTCGAGTTATCAATTACAATAGTTTTCCAGC 以合成的含PI基因的质粒为模板，PCR扩增获得经过密码子优化的PI基因。4. 根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征 在于，步骤（2)中，PCR产物用限制性内切酶NcoI和Xho I酶切后，连接到被同样酶切过的 表达载体pET-32a上，构建融合表达载体pET-32a-PI。5. 根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达系统获得可溶性胰岛素原的方法，其特征 在于，步骤（3)中所述大肠埃希氏菌co/i NKYBYP，其在中国微生物菌种保藏 管理委员...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕玉平，边斐，张晓玮，彭振英，郑玲，陈高，于金慧，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37