一种油松体细胞胚发生与植株再生方法技术

本发明专利技术公开了一种油松体细胞胚胎发生和植株再生方法，包括1)采集油松球果并进行表面灭菌，获得无菌合子胚；2)将无菌合子胚接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织诱导培养；3)将获得的胚性愈伤组织接种于体细胞胚成熟培养基上，进行体细胞胚发生培养；4)将成熟的体细胞胚接种于萌发培养基中进行萌发培养，获得体胚苗；5)将体胚苗进行炼苗、移栽，即得。通过本发明专利技术的诱导方法，首次通过诱导胚性愈伤组织的途径获得了大量稳定生长的油松体细胞胚，并获得完整小植株。本发明专利技术方法中愈伤组织诱导率、体细胞胚发生率、萌发率高，可以在短期内形成大量优良的油松试管苗，可进行规模化、工厂化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及油松离体培养和植株再生的方法，属于属林业行业中的细胞工程种苗繁育

技术介绍
油松(Pinus tabulaeformis C.)，又称红皮松、短叶松等等，为松科松属针叶常绿乔木。油松是我国特有的针叶树树种,为华北地区最主要的造林树种之一，其分布区跨越14个省区。油松姿态优美，主干嶙峋，侧干崎岖，四季常春，不畏风雪严寒，自古被人美誉为具有苍劲有力、刚正不屈的情操。因根系发达，油松具有耐旱、耐寒、耐贫瘠的抗性优势，在我国北方广大生境较差地区的造林中占有特殊地位，是绿化荒山不可取代的树种。油松木材富含松脂，耐腐，适作建筑、家具、枕木、人造纤维等用材，提取的松脂也是一种珍贵的工业原料。自从建国以来,我国不少学者开展了油松优树选择和营建种子园的工作，利用选择的优树进行营养繁殖,以使原植株的优良性状得以保持。但由于油松的营养繁殖很困难，生长周期长,目前能够用于林业生产的仅有嫁接方法。油松种子园投资大,结实晚,面积有限,而建立的种子园又普遍存在种子产量不稳定,球果虫害严重,出种率低等问题。这给油松良种的实生繁殖带来很大问题，不能满足生产的要求，极大的限制了良种的推广和应用，影响了造林质量。组织培养技术是解决良种繁殖的主要途径之一，也是实现遗传转化及转基因技术的前提。体细胞胚胎发生及其植株再生技术是20世纪90年代形成的高新林业生物技术的重要内容之一，可用于优良品种的大规模繁殖和用于遗传转化体系的建立。体细胞胚发生，是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的过程，模拟合子胚发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生和重建过程。这种经体细胞胚胎发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构被称之为体细胞胚或者胚状体。体细胞胚胎发生在保持遗传稳定性，提高繁殖率，缩短培养时间等方面与芽增殖或其他器官发生相比具有无可比拟的优势,尤其在常规营养繁殖困难的木本植物上,更显示出其巨大潜力。体细胞胚胎发生技术克服了传统育种方法的诸多缺点,已逐渐成为植物快速繁殖的重要手段。科研人员发现：①外植体的选择对针叶树体细胞胚胎发生至关重要。外植体的类型及成熟程度决定着体细胞胚胎发生能否成功。同一植物不同组织，器官对相同的外界信号刺激的敏感程度不同,因此感受态也不同。一般来说,材料越幼嫩,其胚性感受态越高，即体胚发生越容易。外植体球果在接种前必须在低温条件下(0‐4℃)冷藏一段时间，一般要冷藏1‐2个月，没有低温处理不能启动。②外植体基因型的选择对针叶树体细胞胚发生存在明显影响。不同家系之间胚性愈伤组织的诱导率，体细胞胚的获得率均不同。③培养基的营养成分及含量对针叶树胚性愈伤组织及体细胞胚的诱导至关重要。在植物组织培养中，诱导体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有显著的特点：①针叶树胚性细胞的第一次分裂为不均等分裂，形成顶细胞和基细胞，具有两极性。其后体积较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而体积较大的基细胞进行少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性。在针叶树中，胚细胞和胚柄细胞不断分裂发育形成一团细胞，即胚性愈伤组织，在松柏类植物中称为胚性胚柄团(embryoic suspensor mass,ESM)。ESM由细胞质浓，体积较小的胚头细胞和高度液泡化、伸长的胚柄细胞组成。②体细胞胚形成后与母体植物或外植体分离，出现所谓生理上的隔离现象。胚性细胞细胞壁加厚，很容易把它们与其它细胞分开。体胚与合子胚十分相似，从一开始就是完整的个体。③体细胞胚胎发生途径相比植物组织培养中器官发生，是最直接体现植物细胞全能性的方式，重演了合子胚形态发生的进程。目前有关植物组织培养技术的各类文献中，尚未见有油松(Pinus tabulaeformis C.)体细胞胚胎发生和植株再生的研究技术。本专利技术的主要目的是针对油松天然结实率低，扦插困难，种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林需要的现状，寻找一种油松体细胞胚胎发生的技术，为油松的大规模无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种新的油松体细胞胚发生和植株再生方法，该方法的油松体细胞胚诱导率高、体胚萌发率高，可以在较短时间内形成大量优良的油松试管苗，可进行规模化、工厂化生产，本专利技术为油松的大规模无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。为实现上述目的，本专利技术一方面提供一种油松体细胞胚发生和植株再生方法，包括如下顺序进行的步骤：1)采集油松球果；2)将油松球果进行表面灭菌后取出其合子胚，获得无菌合子胚；3)将无菌合子胚接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织诱导培养，获得胚性愈伤组织；4)将胚性愈伤组织接种于体细胞胚成熟培养基上，进行体细胞胚发生培养，获得体细胞胚；5)将成熟的体细胞胚接种于萌发培养基中进行萌发培养，获得体胚苗；6)将体胚苗进行炼苗、移栽，即得。本专利技术中所述体细胞胚简称体胚。油松的外植体胚龄对愈伤组织的诱导率影响显著，过嫩或过熟的合子胚均不能得到理想的胚性愈伤组织诱导结果。本专利技术通过大量的实验发现，处于开花散粉后第6‐10周时间段内的油松球果作为外植体，其胚性愈伤组织诱导效果相比于其它时间段内的球果有明显的提高；进一步的实验发现，采集处于油松开花散粉后第44天至第65天这一时间段内的球果作为外植体的合子胚处于球形胚和鱼雷胚阶段，其繁殖效果有进一步的提高，采用处于油松开花散粉后第44天至第58天这一时间段内的球果作为外植体的繁殖效果得到了更进一步的提高，采用处于开花散粉后第51天的油松球果作为外植体取得了最好的繁殖效果：采集油松开花散粉后第51天的球果中的未成熟合子胚在诱导培养基上的出愈率均高于其它时期的外植体，其胚性愈伤组织诱导率为6‐10％、诱导得到的胚性愈伤组织生长速度快，呈透明晶莹状，水分很大，松散状态，经多次继代仍能保持较高的活力；愈伤组织有胚性和非胚性的区别，其中胚性愈伤组织结构松散，半透明，非胚性愈伤组织结构致密，颜色发黄，之后的实验不能得到体胚；胚性愈伤组织发育成体细胞胚诱导率为100％，体胚萌发率达80％，均明显高于其它时段的外植体，所以本专利技术最优选采集处于开花散粉后第51天的油松球果作为外植体。其中，步骤2)中所述灭菌处理包括如下顺序进行的步骤：A)将采集的油松球果首先用洗洁精清洗，接着用自来水冲洗；B)吸干球果表面水分后从球果中取出种子；C)种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种油松体细胞胚发生和植株再生方法，包括如下顺序进行的步骤： 1)采集油松球果； 2)将油松球果进行表面灭菌后取出其合子胚，获得无菌合子胚； 3)将无菌合子胚接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织诱导培养，获得胚性愈伤组织； 4)将胚性愈伤组织接种于体细胞胚成熟培养基上，进行体细胞胚发生培养，获得体细胞胚； 5)将成熟的体细胞胚接种于萌发培养基中进行萌发培养，获得体胚苗； 6)将体胚苗进行炼苗、移栽，即得。

【技术特征摘要】
1.一种油松体细胞胚发生和植株再生方法，包括如下顺序进行的步骤： 
1)采集油松球果； 
2)将油松球果进行表面灭菌后取出其合子胚，获得无菌合子胚； 
3)将无菌合子胚接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织诱导培养，获得胚性愈伤组织； 
4)将胚性愈伤组织接种于体细胞胚成熟培养基上，进行体细胞胚发生培养，获得体细胞胚； 
5)将成熟的体细胞胚接种于萌发培养基中进行萌发培养，获得体胚苗； 
6)将体胚苗进行炼苗、移栽，即得。 
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述的油松球果是处于油松开花散粉后4-11周时间段内的油松球果；优选处于油松开花散粉后6-9周时间段内的油松球果。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤3)中所述胚性愈伤组织诱导培养基是改良1/2LM培养基+2，4-D 1‐6mg/l+6-苄胺基嘌呤0.5-2mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖20-50g/L+琼脂7g/L。 
4.如权利要求1所述的方法，其特征是还包括步骤3A)胚性愈伤组织增殖培养，将步骤3)获得胚性愈伤组织接种于胚性愈伤组织增殖培养基上，进行愈伤组织增殖培养，获得增殖胚性愈伤组织。 
5.如权利要求4所述的方法，其特征是所述胚性愈伤组织增殖培养基是改良1/2LM培养基+2，4-D 0.1‐1.0mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金凤，李慧，赵健，王晓琪，付双彬，康向阳，罗晓芳，张俊琦，胡冬梅，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11