检测类戴奥辛化合物的方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种方法或一种无细胞系统，其可检测试验样本中的类戴奥辛化合物，其使用一衍生自经转染的细胞的全细胞溶解物，该转染细胞可表达一融合蛋白，包含一融合至一报导子胜肽的芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)。提供此方法结合生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)技术藉此增进灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术关于一种检测类戴奥辛化合物的方法及系统。
技术介绍
戴奥辛常由于不完全的燃烧过程所形成，且被归类于一群顽强且多具备毒性的化学物质，亦被称为持久性有机污染物。在它们之中，2,3,7,8-四氯双苯-p-戴奥辛(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)被认为是最具有毒性的一种，且被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)归类为致癌物质。其他种戴奥辛或戴奥辛混合物的毒性亦常被描述与TCDD有关联。传统上，分析化学方法像是色层分析及质谱技术，常被用于判定样品中的戴奥辛含量。然而，这些方法不具成本效益且耗时，更重要地，所得的结果不是直接与戴奥辛毒性相关。所有这些既有的缺点使得分析化学方法不适用于高速筛选。1995年，戴奥辛的生物效应被报导是通过芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)路径所介导的(Fernandezsalguero,et al.,Science 268:722-726,1995)。AHR为细胞质中的常驻蛋白，其与两个热休克蛋白质90(heat shock protein 90，HSP90)分子形成异聚体。戴奥辛分子可轻易地穿过细胞膜与该异聚体结合，使得该异聚体进行转形而导致AHR与HSP90分离。自由型式的AHR被活化以转位至细胞核中，于该处其可与一芳香烃受体核转位子(AHR nuclear translocator，ARNT)蛋白结合。该AHR-ARNT复合物被证实为一转录活化子，其可与DNA中的特定调节序列结合，即包含所谓的戴奥辛应答元件(dioxin responsive element，DRE)序列，以及诱发下游效应基因的表达。由于与戴奥辛结合时，AHR会与HSP90分离并进而与ARNT结合的事实，许多种不同的生物分析方法因此在1990年代建立。例如，Wheelock等人提供一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法(US5,529,899，1993年7月27日申请，1996年6月25日公告)。于该方法中，将试验样本与一异聚体(由不活化的AHR所形成)接触。当试验样本中存在类戴奥辛化合物时，它们将会与AHR结合，并使其从异聚体中被解离出来，并成为一种含有活性AHR，且与类戴奥辛化合物配体结合的复合物。接着，Wheelock等人进一步提供一种使用ARNT以最适化AHR的转形，以检测类戴奥辛化合物的方法(US6,127,136，1996年2月14日申请，2000年10月3日公告)。Okuyama等人提供使用单株化的抗戴奥辛抗体的酵素连结免疫吸附分析法(enzyme-linked immunoabsorbent assay，ELISA)的研究，其灵敏度可达纳米等级(Okuyama,et al.,Anal.Chem.76:1948-1956,2004)。然而，上述方法的灵敏度低而无法满足需求。再者，基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术的活体外生物分析亦被发展，该方法是去评估AHR与其结合对象间的交互作用，以判定试验样本中的戴奥辛含量(请参阅，例如：Lin,et al.,J.Biomed.Sci.15:833-840,2008；及Lin,et al.,Chin.Biosci.50(1):12-25,2007)。于此研究中，一种荧光共振能量转移(FRET)为基础的戴奥辛检测生物分析法被建立，其中AHR及与青荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)和黄荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)融合的ARNT被暂时地共转染入大鼠肝癌细胞株H4IIEC3中。结果显示在转染细胞中，戴奥辛处理以剂量依存的模式向上调控FRET信号。尽管，该方法可达到高灵敏度及专一性，然而考虑到操作活细胞及全细胞固有的变异性所带来的繁琐，使用以细胞为基底作为检测类戴奥辛化合物的系统较为不理想。近来，一种无细胞的分析系统于WO 2005/100991中被提及，其中重组的AHR及ANRT以其部分纯化的形式预计被用于FRET分析中。然而，没有任何实际的数据在这方面被提出。因此，仍亟需开发一具成本效益且高速筛检的方法，以及无细胞的系统，以具高灵敏度方式进行快速且量化的类戴奥辛化合物的检测。
技术实现思路
于本专利技术中，本专利技术人不可预期地发现，一转染细胞的全细胞溶解物中可表达一含有AHR及报导子胜肽的融合蛋白，该融合蛋白易被蛋白酶降解，且该降解与所加入的类戴奥辛化合物的浓度有关系，即呈现一种剂量依存的关系。因此，一种于不含细胞的系统中检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法遂被建立，该方法是通过使用全细胞溶解物以及监控AHR蛋白在类戴奥辛化合物存在的情况下的降解情形。在一方面，本专利技术提供一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，其包含：提供一衍生自一细胞的全细胞溶解物，该细胞经转染而可表达一或多个与一报导子胜肽融合的融合蛋白，其中之一包含一AHR，以及其中该全细胞溶解物包含存在于一游离复合物中的融合蛋白；将试验样本与该全细胞溶解物接触一段足够的时间，以使得游离复合物中的融合蛋白在类戴奥辛化合物存在情况下进行降解；以及检测由该报导子胜肽所生成的可测得信号，以作为融合蛋白的量化指标，以及与一参考信号进行比较，该参考信号是由已知浓度的类戴奥辛化合物所产生，接着判定于试验样本中类戴奥辛化合物的存在或含量。另一方面，本专利技术提供一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，其涉及生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)技术，藉此增进其灵敏度。再另一方面，本专利技术提供一无细胞系统，可用于进行本专利技术所提及的检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法。附图说明前述
技术实现思路
以及后述实施方法，当结合所附的图式时，可更易于理解。出于阐述本专利技术的目的，在图式中显示当前较佳的具体实施例。然而，应理解的是，本专利技术不受限于该具体实施例。于图示中：图1A-图1D为本专利技术中用于转染细胞的质粒的限制性酶切图谱，其中图1A显示AHR的限制性酶切位点，图1B显示AIP及P23的限制性酶切位点，图1C显示ARNT的限制性酶切位点，以及图1D显示HSP90的限制性酶切位点(T为四环霉素抑制子(tetracycline repressor)的结合位置，以及Z为博莱霉素(Zeioc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，其包含：提供一衍生自一细胞的全细胞溶解物，该细胞经转染而可表达一或多个与一报导子胜肽融合的融合蛋白，其中之一包含一芳香烃受体(AHR)，以及其中该全细胞溶解物包含存在于一游离复合物中的融合蛋白；将试验样本与该全细胞溶解物接触一段足够的时间，以使得游离复合物中的融合蛋白在类戴奥辛化合物存在情况下进行降解；以及检测由该报导子胜肽所生成的可测得的信号，以作为融合蛋白的量化指标，以及与一参考信号进行比较，该参考信号是由已知浓度的类戴奥辛化合物所产生，接着判定于试验样本中类戴奥辛化合物的存在或含量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.19 US 13/451,4981.一种检测试验样本中类戴奥辛化合物的方法，其包含：
提供一衍生自一细胞的全细胞溶解物，该细胞经转染而可表达一或多个与一报
导子胜肽融合的融合蛋白，其中之一包含一芳香烃受体(AHR)，以及其中该全细
胞溶解物包含存在于一游离复合物中的融合蛋白；
将试验样本与该全细胞溶解物接触一段足够的时间，以使得游离复合物中的融
合蛋白在类戴奥辛化合物存在情况下进行降解；以及
检测由该报导子胜肽所生成的可测得的信号，以作为融合蛋白的量化指标，以
及与一参考信号进行比较，该参考信号是由已知浓度的类戴奥辛化合物所产生，接
着判定于试验样本中类戴奥辛化合物的存在或含量。
2.如权利要求1的方法，其中该类戴奥辛化合物包含多氯二联苯戴奥辛、多氯
二联苯呋喃、多氯联苯及具有戴奥辛毒性的结构相似物中的任何化合物，或其混合
物。
3.如权利要求2的方法，其中该类戴奥辛化合物为2,3,7,8-四氯双苯-p-戴奥辛
(TCDD)或3-甲基胆蒽(3MC)。
4.如权利要求1的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共
表达AHR，及一AHR结合对象。
5.如权利要求4的方法，其中该结合对象为热休克蛋白90(HSP90)，或一具
相同功能性的变体或其片段。
6.如权利要求4的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共
表达AHR、HSP90及一或多个非HSP90的AHR结合对象。
7.如权利要求6的方法，其中该非HSP90的AHR结合对象选自由芳香烃受体

\t交互作用蛋白(AIP)、P23及其组合所组成的群组。
8.如权利要求4的方法，其中该全细胞溶解物衍生自一经转染的细胞，其可共
表达AHR、AIP、P23及HSP90。

【专利技术属性】
技术研发人员：李心予，
申请(专利权)人：李心予，
类型：发明
国别省市：美国;US