用于乳腺癌诊断的多生物标记物组和其检测方法，以及利用其抗体的乳腺癌诊断试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于诊断乳腺癌的生物标记物组，该生物标记物组包含载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白中的两个或两个蛋白标记物；通过多反应监测在血液样本中检测所述生物标记物组的方法；用于诊断乳腺癌的试剂盒，该试剂盒包含所述生物标记物组中的各蛋白的特异性抗体；以及通过抗原抗体结合反应在血液样品中检测所述标记物组的蛋白的方法。通过MRM方法或抗原抗体结合反应在血液样品中检测蛋白标记物的方法及诊断试剂盒，与使用单一标记物的诊断方法相比，可提供高准确性和敏感性，而且利用从患者获得的血液可简单地诊断乳腺癌，从而有效地用于乳腺癌的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及乳腺癌的诊断。更为特别地，本专利技术涉及能够在血液中有选择地诊断乳腺癌的发病的多生物标记物组和其检测方法，以及包含特异性识别其抗体的乳腺癌诊断试剂盒。 
技术介绍
乳腺癌的起因尚未明确，但有考虑到各种因素，如雌性激素、家族病史、既往病史、生育史和饮食习惯。根据2005年国家统计局的一份调查，近年来乳腺癌的发病率迅速增加，在1998年超过了宫颈癌。因此，在2001年韩国女性癌症病人中乳腺癌占16.1%，超越胃癌，居于首位。尤其在2002年，与2001年相比，乳腺癌（11.1%）被排名为增长最快的癌症。对经历着低出生率、短期母乳喂养、月经初潮早及闭经晚等在生理上精力旺盛的变化的女性而言，受雌性激素刺激的发生会迅速增加，从而乳腺组织的敏感度会上升，而且饮食习惯变得西化且生存环境受到污染，由于这些理由，近年来乳腺癌的发病率有大幅度增加。 鉴于如今西化的实际情况，预计乳腺癌发病率和由乳腺癌导致的死亡率在未来较长一段时间内还会持续增长。通常，乳腺癌引起淋巴结转移或由癌细胞的生长导致的对周围组织的侵犯等症状。然而，大多数的乳腺癌在没有任何症状下可通过自我诊断来进行检查。因此，为了降低由乳腺癌导致的死亡，有效地对乳腺癌进行早期诊断尤为重要（Tuli et al., Breast J., 12: 343-348, 2006）。 为了诊断乳腺癌，已复合使用过一些方法。至今，70%乳腺癌患者是通过自我诊断住院的。然而，这种自我身段具有很难区分恶性肿瘤和良性肿瘤块的缺点，用于诊断乳腺癌的方法包括乳腺X线摄影、超声检查、细针穿刺细胞检查、磁力共振成像等，然而重要的是最终通过活检检查癌症。所述乳腺X线摄影是指用X射线拍摄乳房并鉴定乳腺癌的方法，其能良好地区分肿瘤块是否为良性或恶性。此外，所述乳腺X线摄影为一种用于发现潜伏的肿瘤块的方法，通过自我诊断摸到肿块之前诊断首发癌最有效。然而，所述乳腺X线摄影具有如下缺点，即对如年轻女性一样乳腺良好发达的或乳房小且纤维较多的韩国女性的诊断率有所降低。进一步，存在一种经常用X射线摄影乳房可能会导致乳腺癌的争议。作为这种乳腺X线摄影的替代方法，可使用超声检查。所述超声检查能够有效地区分囊肿和硬质肿块，然而区分恶性肿瘤和良性肿瘤块的能力会有所降低。 为了弥补这种常用诊断方法所带来的缺点，曾试图通过测量患者血液中肿瘤标记物的浓度来诊断乳腺癌（Clinton et al., Biomed Sci. Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui et al., Proteomics. 3: 433-439, 2003; Soletormos et al., 48: 229-255, 2001）。有研究过这些肿瘤标记物的诊断或预后因素的重要性，然而对其的使用仍受限制，本领域中还没有官方推荐的乳腺癌标记物。 鉴于上述情况，为了研发在诊断乳腺癌中使用乳腺癌患者血液中蛋白量会特异性变化的蛋白标记的方法，本专利技术人进行了一些广泛的研究。结果发现，比较根据由多数生物标记物组成的标记物组的乳腺癌的变化模式时与通过单个生物标记物的变化的方法相比能够更有效地诊断乳腺癌。为了有效地跟踪多个蛋白标记物，本专利技术人又发现，可通过多反应监测来监测能够代表各生物标记蛋白的肽的表达水平来简单地诊断乳腺癌。本专利技术是基于上述发现完成的。 
技术实现思路
技术问题 因此，本专利技术的目的在于提供一种用于简易地鉴定乳腺癌的方法，该方法利用了血液中存在的多个生物标记物组的根据乳腺癌发病的变化模式。技术方案 为了达成上述目的，本专利技术提供用于诊断乳腺癌的蛋白标记物组。此外，本专利技术提供一种通过利用三重四极杆质谱仪进行多反应监测来检测血液样本中的生物标记物组的方法。 进一步，本专利技术提供用于乳腺癌的诊断试剂盒，该试剂盒包含组成所述生物标记物组的每种标记物的特异性抗体。 此外，本专利技术提供一种通过利用组成所述生物标记物组的每种标记物的特异性抗体进行抗原-抗体结合反应来检测血液样本中的生物标记物组的方法。 下面，将更为详细地说明本专利技术。 根据一个实施例，本专利技术提供用于诊断乳腺癌的生物标记物组，该生物标记物组包含以下表1展示的五个蛋白标记物中的两个或两个以上的蛋白标记物。本专利技术的生物标记物组优选地包含以下五个蛋白标记物中的三个或三个以上的蛋白标记物，更优选地包含以下五个蛋白标记物中的四个或四个以上的蛋白标记物，最优选地包含以下五个蛋白标记物。 【表1】 本专利技术的组成生物标记物组的第一个蛋白为如SEQ ID NO: 1所示的载脂蛋白C1。载脂蛋白C1与游离脂肪酸结合来减少其在细胞中被酯化（参见Westerterp M. et al., J. Lipid Res., 48:1353-1361, 2007）。第二个蛋白为如SEQ ID NO: 2所示的载脂蛋白（a）。载脂蛋白（a） 具有丝氨酸蛋白酶的活性，而且能起到自体溶解的作用（Salonen E. M.  et al., EMBO J., 8: 4035-4040, 1989）。第三个蛋白为如SEQ ID NO: 3所示的神经细胞粘附分子L1样蛋白。神经细胞粘附分子L1样蛋白为一种参与胞外基质和细胞的粘附中并对神经系统的发育和突触可塑性起重要作用的蛋白质（Wei M. H. et al., Hum. Genet., 103:355-364, 1998）。第四个蛋白为如SEQ ID NO: 4所示的碳酸酐酶1。碳酸酐酶1能够催化二氧化碳的可逆性水合反应和氰胺的水合反应而生成尿素（Briganti F. et al., J. Biol. Inorg. Chem., 4: 528-536, 1999）。最后，第五个蛋白为如SEQ ID NO: 5所示的纤维连接蛋白。 纤维连接蛋白在细胞与基质的粘附中提供蛋白粘附并起到使细胞向胶原迁移的作用（Morla A. et al., Nature, 367: 193-196, 1994）。另外一方面，利用三重四极杆质谱仪的多反应监测（MRM）为一种有选择地分离、检测并定量特性分析物质来监测浓度变化的分析技术。MRM早已应用于小分子的定量分析，从而MRM用在特定遗传性疾病的诊断上。MRM方法具有易于同时检测多个肽且在没有标准物或抗体的情况下能确认正常人与癌症患者之间的蛋白诊断标记候选物的相对浓度差异的优点。进一步，MRM方法具有优异的诊断敏感性和选择性，尤其在利用质谱仪的蛋白质组分析中为了分析血液中存在的复杂的蛋白质和肽而导入了MRM方法（Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics, 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009）。 为了寻找一种在乳腺癌患者的血液中蛋白标记物组的量可特异性地进行变化且能有效地用于乳腺癌的诊断的诊断性蛋白标记物组，本专利技术人从80名乳腺癌患者和80名非患者对照组中获取血液样本，并通过利用三重四极杆质谱仪的多反应监测（MRM）进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其包含选自以下各项的两个或两个以上的蛋白标记物：如SEQ ID NO: 1所示的载脂蛋白C1、如SEQ ID NO: 2所示的载脂蛋白（a）、如SEQ ID NO: 3所示的神经细胞粘附分子L1样蛋白、如SEQ ID NO: 4所示的碳酸酐酶1、以及如SEQ ID NO: 5所示的纤维连接蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.08 KR 10-2012-00237031.一种用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其包含选自以下各项的两个或两个以上的蛋白标记物：如SEQ ID NO: 1所示的载脂蛋白C1、如SEQ ID NO: 2所示的载脂蛋白（a）、如SEQ ID NO: 3所示的神经细胞粘附分子L1样蛋白、如SEQ ID NO: 4所示的碳酸酐酶1、以及如SEQ ID NO: 5所示的纤维连接蛋白。
2.根据权利要求1所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其特征在于，所述生物标记物组包含上述五个蛋白标记物中的三个蛋白标记物。
3.根据权利要求1所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其特征在于，所述生物标记物组包含上述五个蛋白标记物中的四个蛋白标记物。
4.根据权利要求1所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其特征在于，所述生物标记物组包含上述的五个蛋白标记物。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其特征在于，与非患者对照组相比，载脂蛋白C1表达水平的减少、载脂蛋白（a）表达水平的增加、神经细胞粘附分子L1样蛋白表达水平的增加、碳酸酐酶1表达水平的增加、以及纤维连接蛋白表达水平的增加，表明乳腺癌的发病。
6.权利要求1～4中任一项所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组的检测方法，该方法利用三重四极杆质谱仪通过多反应监测来在血液样本中检测所述生物标记物组。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
i） 将受试者血液样本的蛋白质和对照组血液样本的蛋白质制成肽片段；
ii）将上述肽片段导入三重四极杆质谱仪，并对分别代表载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白的靶肽中的两个或两个以上靶肽进行多反应监测；
iii）将所述多反应监测结果表示成相对于内标物的百分比；以及
iv）将与所述受试者和所述对照组有关的检测结果进行比较。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，代表载脂蛋白C1的靶肽具有序列SEQ ID NO: 6且该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 526.8和m/z 605.3；代表载脂蛋白（a）的靶肽具有序列SEQ ID NO: 7且该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 521.8和m/z 634.3；代表神经细胞粘附分子L1样蛋白的靶肽具有序列SEQ ID NO: 8且该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 642.8和m/z 836.4；代表碳酸酐酶1的靶肽具有序列SEQ ID NO: 9且该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 485.8和m/z 758.4；并且，代表纤维连接蛋白的靶肽具有序列SEQ ID NO: 10且该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 555.8 和 m/z 821.4。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，大肠杆菌β-半乳糖苷酶被用作内标物，而且代表大肠杆菌β-半乳糖苷酶的靶肽具有序列SEQ ID NO: 11且一对母离子和子离子分别为m/z 542.3和m/z 636.3。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样本为血浆或血清。
11.一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，其包括有关各蛋白的靶肽及该靶肽的一对母离子和子离子的信息，在通过多反应监测来在血液样本中检测权利要求1～4中任一项所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组时需要所述信息。
12.一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，该试剂盒用来在血液样本中检测载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白的靶肽中的两...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宪秀，申惠胜，姜云范，卢东荣，文炯坤，
申请(专利权)人：佰欧米迪恩公司，首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR