一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：1)乳猪肝预处理；2)均质；3)胃蛋白酶的制备；4)酶解：乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加盐酸溶液至pH值为2.5-3.5，再加入胃蛋白酶搅拌后，将反应容器及其内容物置于水浴锅中水解得到酶解物料；5)灭活；6)离心；7)粗滤：将中性离心液先后经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置和截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行过滤得到粗滤液；8)超滤：粗滤液经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液。本发明专利技术工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，安全性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及促肝细胞生长素
，尤其涉及一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法。
技术介绍
促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝脏中提取的小分子量多肽类混合物，分子量在10000以下。其药理作用主要为可刺激正常肝细胞DNA的合成，促进肝细胞再生，对损伤的肝细胞有保护作用，促进肝功能的恢复，还有调节机体的免疫功能和抗肝纤维化作用。临床上用于治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化等。目前，针对促肝细胞生长素这一生物制剂类药物，已经有很多专利和文献报道。在专利ZL03116052.2中，公开了一种促肝细胞生长素注射液及制备方法，其中的肝细胞生长素为从乳猪中提取分离获得的一种活性蛋白质，占总蛋白含量的60％以上，该促肝细胞生长素是通过以下方法制备：1)匀浆；2)搅拌：加提取液，室温下低速60rpm搅拌1h；3)加热：水浴加热提取罐，液体温度达到95℃时停止加热，保持15-20分钟；4)过滤；5)提纯：将过滤液上样至DEAE Sepharose FF柱中，采用含有氯化钠的PBS溶液进行洗脱，再用超滤膜除盐。该制备方法的工艺繁琐，还需要加盐的洗脱液洗脱后再脱盐，这些操作步骤都会损失活性物质的含量，造成提取物活性低，提取率低。
技术实现思路
基本
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，采用酶解和超滤工艺，工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。本专利技术提出的一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100-3250rpm的转速研磨2-3.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为5-6:4.5-5.5加入搅拌机中，以310-325rpm的转速搅拌14-17min得到乳猪肝匀浆；S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.2-1.5wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为22-25:27-30，将反应容器及其内容物置于47-50℃的水浴锅中浸提63-66min得到浸提液，将浸提液以5800-6200rpm的转速离心22-23min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4-6mol/L盐酸溶液至pH值为2.5-3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190-205rpm的转速搅拌19-22min后，将反应容器及其内容物置于37-45℃的水浴锅中水解6-8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.7-1；S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温12-15min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000-4300rpm的转速离心14-17min后，将上清液取出滴加4-6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2得到中性离心液；S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.04-0.07MPa；S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13-0.16MPa，回流压力为0.04-0.07MPa。优选地，S3中，取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.3-1.4wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为23-24:28-29，将反应容器及其内容物置于48-49℃的水浴锅中浸提64-65min得到浸提液，将浸提液以5900-6100rpm的转速离心22.3-22.6min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶。优选地，S4中，将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4.5-5.5mol/L盐酸溶液至pH值为2.7-3.2，再加入S3得到的胃蛋白酶以195-200rpm的转速搅拌20-21min后，将反应容器及其内容物置于40-42℃的水浴锅中水解6.7-7.8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99.4-100.2:0.8-0.9。优选地，S6中，将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4100-4200rpm的转速离心15-16min后，将上清液取出滴加4.7-5.6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7.1得到中性离心液。优选地，包括如下步骤：S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3200rpm的转速研磨3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以315rpm的转速搅拌15.5min得到乳猪肝匀浆；S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.3wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为23:28，将反应容器及其内容物置于490℃的水浴锅中浸提65min得到浸提液，将浸提液以6000rpm的转速离心22.5min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5mol/L盐酸溶液至pH值为3，再加入S3得到的胃蛋白酶以200rpm的转速搅拌20min后，将反应容器及其内容物置于40℃的水浴锅中水解7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为100:0.9；S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.8℃，保温14min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4200rpm的转速离心15min后，将上清液取出滴加5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7得到中性离心液；S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超...

【技术保护点】
一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3‑5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1‑3mm的乳猪肝颗粒；S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100‑3250rpm的转速研磨2‑3.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为5‑6:4.5‑5.5加入搅拌机中，以310‑325rpm的转速搅拌14‑17min得到乳猪肝匀浆；S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.2‑1.5wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为22‑25:27‑30，将反应容器及其内容物置于47‑50℃的水浴锅中浸提63‑66min得到浸提液，将浸提液以5800‑6200rpm的转速离心22‑23min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4‑6mol/L盐酸溶液至pH值为2.5‑3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190‑205rpm的转速搅拌19‑22min后，将反应容器及其内容物置于37‑45℃的水浴锅中水解6‑8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99‑101:0.7‑1；S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81‑82℃，保温12‑15min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000‑4300rpm的转速离心14‑17min后，将上清液取出滴加4‑6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8‑7.2得到中性离心液；S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.04‑0.07MPa；S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13‑0.16MPa，回流压力为0.04‑0.07MPa。...

【技术特征摘要】
1.一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括如
下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，
沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞
肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100-3250rpm的转速
研磨2-3.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为5-6:4.5-5.5
加入搅拌机中，以310-325rpm的转速搅拌14-17min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，
加入1.2-1.5wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为
22-25:27-30，将反应容器及其内容物置于47-50℃的水浴锅中浸提63-66min
得到浸提液，将浸提液以5800-6200rpm的转速离心22-23min，取上清液进行
低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4-6mol/L盐酸
溶液至pH值为2.5-3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190-205rpm的转速搅拌
19-22min后，将反应容器及其内容物置于37-45℃的水浴锅中水解6-8h得到酶
解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.7-1；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温12-15min后，
将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000-4300rpm的转速
离心14-17min后，将上清液取出滴加4-6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2
得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超

\t滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行
第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为
0.04-0.07MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤
得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13-0.16MPa，回流压力为
0.04-0.07MPa。
2.根据权利要求1所述高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，其特
征在于，S3中，取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入
1.3-1.4wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为23-24:28-29，
将反应容器及其内容物置于48-49℃的水浴锅中浸提64-65min得到浸提液，将
浸提液以5900-6100rpm的转速离心22.3-22.6min，取上清液进行低温干燥得
到胃蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述高提取率高活性促肝细胞生长素...

【专利技术属性】
技术研发人员：王康林，马婕，陈玉海，
申请(专利权)人：合肥平光制药有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34